作者：张米娜，于月成，黄侃，宋晖，张红菊，王晓红
【关键词】 早孕
Protective effect of insulinlike growth factors on early pregnancy
【Abstract】 AIM: To detect the expressions of insulinlike growth factorⅠ (IGFI) in villus and IGFII in decidua and the levels in mother serum, and to explore their relationship with the embryogenesis of early pregnancy. METHODS: Expressions of IGFI and IGFII were examined by immunohistochemical SP method; the mRNA expressions of IGFI and IGFII were detected by in situ hybridization (ISH); serum IGFI and IGFII levels were determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The expressions of IGFI and IGFII both protein and mRNA were lower in the abnormal villus and decidua of pregnancy termination than those of normal villus and decidua of normal pregnancy （P<0.01）. Serum levels of IGFI and IGFII in normal pregnancy women were much higher than those of abnormal pregnancy women（P<0.01）. CONCLUSION: IGFI and IGFII may play important roles in the regulation of fetal growth, the decrease of IGFI and IGFII levels in villus, decidua and serum may be the key factor contributing to the embryogenesis termination of early pregnancy. So IGF I and IGFII can serve as 2 parameters in examining the fetal safety.
【Keywords】 insulinlike growth factor I; insulinlike growth factor II; early pregnancy; villus termination; deciduas
【摘要】 目的：探讨胰岛素样生长因子I和II（IGFI和II）在正常胚胎发育及早期胚胎发育终止绒毛及蜕膜组织中的表达及其在母体血中水平的改变与胚胎发育的关系. 方法：分别采用免疫组织化学SP法和原位杂交法检测正常胚胎发育绒毛及早期胚胎发育终止绒毛中IGFI和蜕膜中IGFII蛋白的表达以及IGFI mRNA和蜕膜中IGFII mRNA的表达；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测正常妊娠及早期胚胎发育终止孕妇血中IGFI和II水平的变化. 结果：免疫组化结果显示，正常妊娠绒毛中IGFI和蜕膜中IGFII的表达明显高于胚胎发育终止组（P＜0.01）；原位杂交结果显示，正常妊娠组绒毛中IGFI和蜕膜中IGFII mRNA的表达明显高于胚胎发育终止组（P＜0.01）；正常妊娠组母血中IGFI和II水平显著高于胚胎发育终止组（P＜0.01）. 结论：IGFI和II在绒毛组织中的表达及母血中的水平的升高对早期胚胎发育有重要的保护作用，其含量的减少可能是导致胚胎死亡的重要原因之一. IGFI和II可能成为预测胎儿安危的指标之一.
【关键词】 胰岛素样生长因子I； 胰岛素样生长因子II； 早孕； 绒毛；蜕膜
0引言
近年来已有大量研究表明胚胎在宫内的生长发育是一个多因素调节的过程. Guidice等［1］证实胰岛素样生长因子I（IGFI）具有调节胎儿生长发育的作用，但是有关具体作用途径和作用机制尚不清，而子宫内膜中胰岛素样生长因子II（IGFII）的含量随月经周期而改变，并与卵巢激素的作用密切相关［2-3］，因此，推测IGFs在早期胚胎发育过程中可能起着重要作用. 我们通过检测正常胚胎发育孕妇及胚胎发育终止孕妇血中的IGFI水平和绒毛中的IGFI及蜕膜中IGFⅡ表达的变化，探讨IGFI和IGFⅡ对早期胚胎发育的保护作用.
1材料和方法
1.1材料选取200309/200410西京医院妇产科门诊48例经B超证实胚胎发育终止而行清宫术者的绒毛组织和蜕膜组织为实验组，56例因避孕失败而实施人工流产的绒毛组织和蜕膜组织为对照组. 两者妊娠天数均小于84 d. 入选对象均为健康女性，年龄(24±2.8)岁. 兔抗人IGFI和II多克隆抗体及通用型超敏SP试剂盒（北京百灵克试剂公司）；IGFI和II检测试剂盒（DSL公司）；IGFI和II原位杂交试剂盒（武汉博士德试剂公司）.
1.2方法
1.2.1母血中IGFI和IGFII含量的检测术前均空腹抽取静脉血3 mL，不抗凝，离心后取血清， -20℃冷冻冰箱保存. 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，操作方法严格按照试剂盒说明进行. 反应终止后在EL312e型酶标仪测吸光度值，每份标本均测双份，取平均值，根据标准曲线算出IGFI和II含量.
1.2.2绒毛组织中IGFI和蜕膜组织中IGFII的表达采用免疫组织化学SP染色法检测. 将绒毛组织和蜕膜组织经40 g/L多聚甲醛固定后，常规制作4 μm石蜡切片，一抗为兔抗人IGFI和II抗体（1∶100）,二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，以DAB显色. 具体步骤按说明书进行. 对照设置：免疫组化染色中分别以已知IGFI阳性的肝癌和IGFII阳性的乳腺癌作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照. 检测结果的判定：以胞质中出现黄色和棕黄色颗粒为阳性信号.
1.2.3绒毛组织中IGFI mRNA和蜕膜组织中IGFII mRNA水平的表达采用原位杂交法检测. 将石蜡切片常规脱蜡至水，加30 mL/L H2O2室温处理10 min，用DEPC水洗2×5 min. 加胃蛋白酶于37℃消化30 min，以0.5 mol/L PBS洗3×5 min，于40℃预杂交3 h. 用滤纸吸去预杂交液，然后杂交过夜，最后用DAB显色. IGFI和II mRNA探针为地高辛标记的原位杂交液，一抗为HRP标记的鼠抗地高辛IgG. 对照设置：以试剂盒内配置的阳性切片（肝癌）作为阳性对照，信捷职称论文写作发表网，以不加含有标记探针的原位杂交液作为阴性对照. 检测结果的判定：以胞浆中出现黄色和棕黄色颗粒为阳性信号.
1.2.4图像分析用MIAS300型图像分析仪，输入装置为Olympus BH2显微镜和台湾产MTV180型CCD摄像头，显微放大倍数400倍，普通光源照明. 将免疫组化染色和原位杂交染色切片显微镜下观察视野输入图像分析仪的高分辨图像监视器上，对阳性产物相对含量进行测定. 在光镜下（×100）每例随机取样测5个蜕膜断面，10个单位面积，每组共测50个单位面积，计算每个单位面积阳性产物的相对含量. 取其平均值代表该切片阳性物质的相对含量.
统计学处理： 数据以x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件，组间比较用t检验，P<0.05表示有统计学意义.
2结果
2.1母血中IGFI和IGFII的含量ELISA检测结果表明，对照组（正常妊娠）母血中IGFI含量为（194±145）μg/L，IGFII含量为（184±15）μg/L；而实验组母血中IGFI含量为（125±13）μg/L，IGFII含量为（125±13）μg/L；二者之间差异显著（P<0.01）.
2.2绒毛组织中IGFI和蜕膜组织中IGFII的表达免疫组化检测结果表明，IGFI在对照组的绒毛组织中的表达以阳性及强阳性为主；而在实验组中的表现阴性和弱阳性为主. IGFII在对照组中的表达以阳性和强阳性为主；而在实验中的表达则以阴性和弱阳性为主.两组之间差异显著（P<0.01,表1,图1）.
表1绒毛组织中IGFI，IGFI mRNA和蜕膜组织中IGFII，IGFII mRNA的表达（略）
bP＜0.01 vs对照.
图1绒毛组织IGFI（A）和蜕膜组织IGFII（B）的阳性表达(表达在胞质和胞膜上)SP ×400（略）
2.3绒毛组织IGFI mRNA和蜕膜组织IGFII mRNA的表达原位杂交检测结果表明，IGFI mRNA在对照组的绒毛中表现为强阳性；而在实验组中表现为阴性和弱阳性；IGFII mRNA在对照组的蜕膜中表现为强阳性；而在实验组中表达为阴性和弱阳性. IGFI和II mRNA在对照组的阳性产物含量明显高于实验组（P<0.01，表1，图2）.
图2绒毛组织IGFI Mrna (A)和蜕膜组织IGFII mRNA (B)的阳性表达(表达在胞质和胞膜上)ISH ×400（略）
3讨论
胚胎是动物个体发育的重要阶段，多种生长因子和激素在胚胎生长发育
