作者：张雪梅，尹一兵，孟江萍，许颂霄，王虹，信捷职称论文写作发表网，黄远帅
【摘要】 目的： 探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系. 方法： 采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株，通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化，并应用RT?PCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶（phd），分泌型IgA结合蛋白（sIgA），肺炎链球菌自溶酶（lytA），肺炎链球菌神经氨酸酶A （nanA）和肺炎链球菌溶血素（ply）在细菌感受态发生过程中的表达，并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同. 结果： 野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子（CSP）诱导表达增加；虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异，但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达. 结论： comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.
【关键词】 链球菌，肺炎；自转化，细菌；毒力基因
0引言
肺炎链球菌是目前发现转化效率最高的一种细菌，一些可被感受态刺激蛋白（CSP）诱导表达的蛋白基因变异时，肺炎链球菌的毒力减弱［1-2］. 我们已发现调控肺炎链球菌转化的一个关键基因comE基因缺陷后，其毒力会减弱［3］.
近来发现了一个新基因comX与肺炎链球菌转化相关，其编码的蛋白具有δ因子的作用，可诱导一系列转化相关的晚期基因如cinA?recA, cilABCDE, coiA和cfl等的表达，使细菌发生转化［4-5］. 我们拟通过构建相关基因的缺陷菌株，比较其与野生菌株的毒力因子表达，以探讨基因comX是否与细菌毒力表达相关及相关的分子机制.
1材料和方法
1.1材料试验菌株及动物 2型光滑型 (SⅡ型)肺炎链球菌： 中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供，主要遗传特征经鉴定合格. 健康BALB/c小鼠38只，由第三军医大学动物中心提供. 体质量18~22 g，随机分为三组，野生菌株组（wt， n=12），comE基因缺陷菌株组（comE-， n=13）和comX全基因缺陷菌株组(n=13). 主要试剂 C+Y半合成培养基：含5 g/L Yeast抽提物（Lacks and Hotchkiss,1960）. 肺炎链球菌CP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）、肺炎链球菌CPM17的染色体DNA(含有标志基因红霉素抗性基因erm的comE断裂基因)、肺炎链球菌CPM10的染色体DNA(含有标志基因红霉素抗性基因erm的comX1断裂基因和标志基因四环素抗性基因tet的comX2断裂基因),CSP，由美国Morrison教授提供. 引物序列由上海生物工程技术有限公司合成(表1)，毒力因子序列由日本遗传子研究所设计并合成(表2).
表1扩增各基因的引物序列（略）
表2毒力基因所用的引物（略）
注：phd为透明质酸酶,sIgA为分泌型IgA结合蛋白,lytA为肺炎球菌自溶酶,nanA为肺炎球菌神经氨酸酶A, ply为肺炎球菌溶血素.
1.2方法
1.2.1肺炎链球菌comE, comX1, comX2和comX全基因缺陷菌株的制备以菌株CPM17的染色体DNA为模板，PCR扩增出comE断裂基因（comEup?erm?comEdw）片段，以菌株CPM10的染色体DNA为模板，PCR扩增出comX1断裂基因（comX1up?erm?comX1dw）片段和comX2断裂基因（comX2up?tet?comX2dw）片段［4］，胶回收纯化后储于-20℃备用.
将肺炎链球菌培养于CTM培养基（C+Y培养基、1 mmol/L的CaCl2和2 g/L牛血清白蛋白）中至A550 nm=0.1左右，加入感受态刺激因子（CSP）20 μg/L，然后分别加入comE, comX1, comX2断裂基因的PCR产物各1 g/L于不同的试管中，37℃孵育90 min，然后分别铺于含红霉素（0.25 mg/L）,四环素（0.25 mg/L）和二者都含的血平板（TSA）上，于37℃孵箱培养24～48 h，挑取菌落于C+Y培养基中培养，当细菌密度为A620 nm=0.2左右时，冻于-70℃冰箱保存，此即为转化菌落.
1.2.2comE, comX1, comX2和comX全基因缺陷菌株的鉴定将野生菌与缺陷菌同时做转化实验，选用CP1250的DNA为外源基因;提取野生菌与缺陷菌的染色体DNA，分别以erm和tet的引物［5］进行PCR扩增.
1.2.3小鼠腹腔感染毒力试验［6］将过夜培养于C+ Y培养基中的肺炎链球菌稀释20倍于C+Y培养基中培养6 h，到其A620 nm>0.6, 然后用无菌PBS稀释成适当的浓度. 经过浓度梯度感染预实验，将菌株稀释成5×105 cfu/L，分别在Balb/c小鼠腹腔内注入0.1 mL菌液，记录小鼠死亡时间，可得到各菌株的半数致死时间.
1.2.4半定量RT?PCR测定毒力基因的表达
1.2.4.1总RNA的提取： 将野生型肺炎链球菌及其各基因缺陷菌株（comE-, comX-, comX1-和comX2-）分别培养于CTM培养基中，在A550 nm分别为0.1左右时各加入CSP至100 μg/L ，诱导感受态发生. 分别在加入CSP的0, 10, 20 min三个时相取1 mL菌液，冻于-70℃冰箱，用以RNA提取. 将所取的样本按Qiagen试剂盒的总RNA提取法提取总RNA.
1.2.4.2半定量RT?PCR以cDNA为模板［3］，以基因16S rRNA（为内参）和五种毒力基因的引物（序列见表2），分别PCR扩增相应片段. 循环参数为：94℃ 1 min, 55℃ 40 s, 72℃ 45 s，30个循环，琼脂糖电泳（Marker: ФX174DNA/HinfⅠ），照相.
统计学处理： 小鼠毒力实验得到的各菌株半数致死时间结果用mann?whitnay U检验分析. 毒力基因的mRNA表达图谱通过软件Quantity?one 3.0 version分析数据，结果用t检验进行统计学分析.
2结果
2.1肺炎链球菌基因缺陷菌株的构建及特性利用comE, comX1和comX2的断裂基因PCR产物转化野生菌株分别得到转化菌株comE-, comX1-, comX2-和comX全基因缺陷菌株comX-，转化率分别为4.3×10-3%, 7.8×10-3%, 1.2×10-3%和9.6×10-5%. 将野生菌株与基因缺陷菌株同时转化抗链霉素（str）的DNA，野生菌株获得转化菌株，转化率为5.6×10-1%，而各基因缺陷菌株均无菌落生长. 提取野生菌与基因缺陷菌的染色体DNA，以erm和tet的引物做PCR，野生菌株无对应产物，comE-, comX1-, comX2-和comX-菌株都在726 bp（erm片段）处有产物，comX2-和comX-都在1400 bp（tet片段）处有产物（图1），Marker为Gene RulerTM 1 kb DNA Ladder，购于MBI公司. 鉴定结果表明各基因缺陷菌株构建成功.
A： comX-菌株有两种PCR产物: tet(comX-t, 1400 bp) 和erm(comX-e, 726 bp)， comE-菌株有一种PCR产物: erm(comE-e, 726 bp)，而野生菌株(wt)没有相应PCR产物. B： comX1-菌株有一种PCR产物erm (comX1-e, 726 bp). C： comX2-菌株有一种PCR产物tet(comX2-t, 1400 bp). M: marker.
图1通过PCR鉴定所得的基因缺陷菌株comE-, comX-, comX1-和comX2-（略）
2.2小鼠毒力实验野生菌株和comX基因缺陷菌株comX-的半数致死时间均为1.9 d，而comE基因缺陷菌株comE-的半数致死时间为2.9 d，三者之间差异无统计学意义（P>0.05）.
2.3半定量RT?PCR分别测定各株肺炎链球菌在加入CSP的0，10， 20 min这3个时相时毒力基因Phd, sIgA, lytA, nanA和ply的mRNA表达量(表3). 显示在未加入CSP时，野生菌株和基因缺陷菌株的毒力基因都有一定量的基础表达. 通过统计学分析各基因在不同菌株的不同时相的表达，结果表明：在加入CSP后10 min时，野生菌株的5个毒力基因phd, sIgA, lytA, nanA和ply的表达量都有不同程度的增加（P<0.05），而各基因缺陷菌株无此现象. 相对于野生菌株，基因缺陷菌株comE-和comX-菌株的毒力基因ply的表达量都明显下降（P<0.05），而其它毒力基因的表达无显著差别. 而comX2-菌株的毒力基因sIgA的表达量显著升高（P<0.05）. 相对于comX-菌株，comX1-和comX2-菌株的毒力基因ply表达量显著增加（P<0.05）；comX1-菌株的毒力基因nanA表达量显著增加（P<0.05），comX2-菌株的毒力基因sIgA表达量显著增加（
