作者:郑红，孙保存，王立梅，李希，王家仓
【摘要】 目的 采用分子信标实时定量PCR方法检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的表达量，并分析其与临床资料之间的关系。方法 设计Survivin基因特异性分子信标探针和引物，以cDNA克隆重组质粒为标准品，建立Survivin基因实时定量检测方法；并检测胃癌样本中Survivin基因mRNA的模板拷贝数。结果 Survivin基因mRNA分子信标实时定量检测方法的线性范围为103～1010拷贝数，批间变异为28.16%，批内变异为13.34%，灵敏度为42个拷贝数，平均回收率为109.83%；胃癌组织、癌旁组织和正常组织以及胃良性病变组织间比较，mRNA模板拷贝数差异有显著性（P＜0.05）；胃癌样本中mRNA模板拷贝数与淋巴结转移和2年生存期以及病理类型相关（P＜0.05）。结论 成功建立Survivin基因分子信标实时定量检测方法。胃癌中该基因表达的模板拷贝数可作为预测淋巴结转移、评价预后的一个重要指标。
【关键词】 分子信标；实时定量PCR；Survivin；胃癌
分子信标；实时定量PCR；Survivin；胃癌
Real Time PCR detection of Survivin expression by molecular beacon in gastric carcinoma
【Abstract】 Objective To develop a real time fluorescent quantitative method based on molecular beacon technique and quantification of mRNA expression of survivin gene in gastric carcinoma.Methods A molecular beacon probe and primers were designed and applied in the detection of survivin gene，while recombination plasmid containing the sequence of survivin was standard. The copies of survivin expression were detected in gastric carcinoma，and relationship between copies and clinical data was analyzed. Results A linear standard curve was obtained between 103 and 1010 copies. The inter-and intra-assay coefficient variation (CV) was 28.16% and 13.34%，respectively. The sensitivity of this assay was 42 copies. The average recovery was 109.83%. The copies of survivin expression were significantly higher in gastric carcinoma than in the other groups (P＜0.05). There was a relationship between copies of survivin gene with lymph node metastasis，poor survival and histological types. Conclusion The method can detect copies of survivin expression. It might be an important indicator in predicting lymph nodes metastasis and evaluating the prognosis.
【Key words】 molecular beacon；real time PCR；survivin；gastric carcinoma
实时定量PCR方法是近年发展起来的一种新的PCR定量技术，由于在PCR反应中引入了荧光探针，可以通过检测扩增过程中荧光信号的有无和强弱来判定目的基因的有无及表达量多少。分子信标（molecular beacon）探针就是其中一种荧光探针，它是在核酸杂交原理和荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)现象的基础上开发出来的，可用于实时定量检测基因的表达水平［1，2］。
Survivin是1997年［3］发现一种特殊结构和性质的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP），它在终末分化的成人组织中很少表达，而在绝大多数肿瘤细胞中高表达［4～6］。本研究应用分子信标探针实时定量PCR技术检测了胃癌组织中Survivin 基因的mRNA表达情况，分析其与不同病理类型及临床资料之间的关系，探讨Survivin基因在胃癌的诊断、治疗和预后等方面的可行性。
1 材料与方法
1.1 标本收集 随机收集天津医科大学附属肿瘤医院胃肠肿瘤外科2001年11月～2003年11月手术切除的胃癌组织标本69组，每组包括肿瘤组织、癌旁组织、手术切端正常组织三份标本，离体后立即放入液氮中，后转入-80℃冰箱保存。男38例，女31例；年龄38～86岁，中位年龄56岁；按国际抗癌联盟（UICC）胃癌TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期23例，Ⅲ期29例，Ⅳ期14例；按组织学类型分类：低分化腺癌22例，乳头状腺癌2例，管状腺癌13例，黏液腺癌5例，黏液细胞癌10例，印戒细胞癌2例，混合性癌15例；按分化程度分组：乳头状腺癌和管状腺癌为分化较好组15例，其余为分化较差组54例；按生存期分组：24个月无转移复发为生存组，有转移复发或死亡为转移死亡组。经病理证实的胃良性标本47例，其中胃息肉1例，幽门口溃疡1例，胆汁反流胃炎1例，球部溃疡1例，豆疹样胃炎1例，慢性胃炎42例。
1.2 定量检测标准品制备——Survivin基因cDNA克隆 克隆方法如文献［7］所述，概括如下：取胎儿的脾脏提取总RNA，RT-PCR方法扩增出Survivin基因读码框部分cDNA，构建重组质粒。经序列分析证实克隆成功后，小量制备重组质粒，RNase A 消化RNA并纯化后，以260nm吸光度值计算含量，根据分子量计算拷贝数；倍比稀释后作为实时荧光定量检测的标准品。
1.3 引物和探针 根据GeneBank中Survivin mRNA序列，通过Oligo6.0分析软件设计引物和探针（上海生工合成标记）。上游：5’-CCT GGC AGC CCT TTC TCA-3’（75～92），下游：5’-TCA GTG GGG CAG TGG ATG-3’ （178～195），探针：5’-CCG CAT CTC TAC ATT CAA GAA CTG GCA TGC GG-3’ （106～125），其中画线部分为分子信标探针中与靶序列无关的自身互补序列，斜体部分为Survivin基因探针的互补序列，检测片段大小121bp；探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团DABCYL。
1.4 实时定量检测 20μl反应体系中加入10μl PCR SuperMix (Invitrogen公司产品)，上、下游引物和分子信标探针各200nM，每管加入不同模板拷贝数的标准品或100 ng待测样本，补齐体积到20μl。反应条件为50℃温育2min，95℃预变性2min；95℃ 20s，60℃ 60s，40个循环。每个标准或样本重复2次。以每个标准拷贝数的对数为横坐标，以荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数（Ct值）为纵坐标，绘制标准曲线；并以精密度和回收率考证方法；根据被检测样品的Ct值，通过标准曲线计算出样本的模板拷贝数。
1.5 统计学方法 数据分析使用SPSS11.0软件包进行。Survivin mRNA的模板拷贝数以均值加减标准差（x±s）表示，模板拷贝数转换为对数进行统计分析，不同来源的组织样本间以及肿瘤组织中Survivin模板拷贝数与病理类型间的比较采用方差分析，与临床参数之间的比较采用独立样本t检验。
2 结果
2.1 标准品克隆 经过测序分析并与GeneBank比较，重组质粒的第385位发生碱基改变，由 A变为G，致密码子编码由赖氨酸变为谷氨酸。分子信标定量检测位置在1、2外显子的第75～195位之间，阳性克隆中碱基的改变并不影响作为定量检测标准品的使用。
2.2 实时定量检测 标准品检测范围103～1010个拷贝（见图1），直线斜率a=-3.2253，截距b=46.2569，相关系数r=0.9954；批内变异为13.34%（n=20），批间变异为28.16%(n=5)，回收率为109.83%，信捷职称论文写作发表网，实验中得到的最小检出量为42个拷贝数。
2.3 Survivin模板拷贝数与临床资料及病理类型之间的关系 本研究设定＞40个循环仍无荧光信号明显增加的样本，Survivin mRNA表达为阴性，数值以“0”计入统计资料。不同组织中Survivin mRNA模板拷贝数的结果见表1，肿瘤组织与其相应的癌旁组织比较差异无显著性（P=0.076），与正常和良性组织比较差异有显著性（P=0.000）；癌旁与正常和良性组织比较差异有显著性（P＜0.05）；正常组织与良性组织比较差异无显著性（P=0.085）。肿瘤组织中Survivin mRNA模板拷贝数与临床资料之间的关系见表2，与病理类型之间的关系
