图1 标准品的实时荧光定量检测
表1 实时定量检测不同组织中mRNA模板拷贝数
表2 肿瘤组织mRNA模板拷贝数与临床资料的关系临床特征
表3 肿瘤组织mRNA模板拷贝数与病理类型的关系病理类型
3 讨论
分子信标探针是由Tyagi［8］首先建立起来的，它是一种具有“茎环”结构的发夹式探针，茎部分是与目的基因无关的互补序列，环部分是与目的基因互补的序列，探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团。无目的基因存在时，由于探针呈发夹结构，激发光作用时荧光基团吸收的能量通过荧光共振能量转移传递给与之接近的淬灭基团，以热的形式散失而不产生荧光；当有目的基因存在时，分子信标探针的“环”部分与目的基因互补结合，形成比发夹式探针更稳定的杂交二聚体，此时荧光基团和淬灭基团远离，在激发光作用下，荧光基团吸收的能量不能传递给淬灭基团，从而产生荧光。
影响分子信标探针构型稳定性的参数有茎环长度之比、茎的长度和GC含量等。首先，环的长度至少应是茎长的2倍以上，才可保证探针与目的基因杂交后，荧光基团与淬灭基团充分远离。其次，茎的长度应在6～12nt之间，序列中GC含量一般应在50%以上，方能有利于形成比较稳定的发夹结构。另外，定量检测扩增的片段大小一般应＜200bp，最好是在150bp以下，这样才可忽略扩增效率的差异。本研究所设计的探针茎长6bp，环长20bp，环长是茎长的三倍以上；茎中的GC含量达66.7%（4/6）；扩增片段的大小为121bp，完全满足作为荧光探针进行定量检测的需要。
Survivin是IAP家族的重要成员，是迄今发现的最强的凋亡抑制蛋白，其抗凋亡作用远大于bcl-2家族，与肿瘤的发生发展关系密切。Survivin即可特异性地结合Caspase-3和Caspase-7而阻断刺激诱导的细胞凋亡过程，同时还可以通过与周期蛋白激酶CDK4结合释放p21-CDK4复合体上的p21，游离的p21再与Caspase-3结合，从而抑制Caspase-3的活性，阻止细胞凋亡［9］。因此引起了研究者的广泛注意。目前检测Survivin基因mRNA表达多采用定性或半定量RT-PCR方法［10，11］，得到的是模板经PCR扩增以后的结果，而非原始模板量；原位杂交的方法［12］ 所得到的结果是阳性率；即使采用实时定量的方法［13］，也是以管家基因作为参比进行相对定量。
本研究以Survivin基因重组质粒为标准品，测定了胃癌样本中Survivin基因mRNA绝对模板拷贝数，并分析了拷贝数与临床资料之间的关系。结果显示，Survivin基因模板拷贝数与有无淋巴结转移显著相关，与2年生存期显著相关，与病理类型显著相关。黏液腺癌组与乳头状/管状腺癌组、低分化腺癌组比较，黏液细胞/印戒细胞癌组与低分化腺癌组比较，混合性癌与低分化腺癌组比较，差异有显著性（P＜0.05）。由表3可知：分化较差组的黏液腺癌mRNA表达在几十个拷贝数，显著低于分化程度较好的乳头/状管状腺癌组，黏液细胞癌/印戒细胞癌组mRNA表达在几千个拷贝数，与乳头状/管状腺癌组比较虽无统计学差异（P=0.157），但拷贝数两者相差几十倍，这可能与黏液细胞/印戒细胞癌组的变异较大有关。与乳头状/管状腺癌和低分化腺癌比较，胃黏液癌组织中Survivin基因mRNA表达较低，是否与它们之间发生发展的机制不同有关，有待于进一步研究。
不同临床分期比较，Survivin基因模板拷贝数无统计学差异，Ⅰ、Ⅱ期组平均值略高于Ⅲ、Ⅳ组。可能是因为Survivin基因的过表达在胃癌的发生、发展过程中是一个比较早期的事件，在初期即发生了重新表达；随着肿瘤的进展，Survivin基因表达增强，其自身存在的负性变异体Survivin-2B［14］以及其下游基因被激活，抑制Survivin基因的进一步表达。不同分化程度组间比较同样无统计学差异，由表2可知，分化程度较差组模板拷贝数低于分化程度较好组，如将分化程度较差组进一步分为黏液癌组和低分化腺癌组，三者之间比较差异有显著性（P=0.002）。
总之，胃癌样本不同病理类型中Survivin基因mRNA表达的模板拷贝数存在差异，低分化腺癌最高，乳头状/管状腺癌次之，黏液癌较低；有淋巴结转移表达高于无淋巴结转移；2年转移死亡者表达高于未转移复发者，可成为评估胃癌的生物学行为及判断预后的指标。
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