缺铁对大鼠胃排空功能的影响及其机制
作者：佚名； 更新时间：2014-12-13
关键词： 贫血 缺铁性 胃 病理生理学 胃肠疾病 疾病模型 动物
摘 要 目的：研究缺铁对大鼠胃排空功能的影响及其机制.方法：将4wk龄Wistar大鼠60只随机分为两组：缺铁性贫血（IDA）组和正常对照组，各30只，分别饲以低铁和正铁饲料（含铁量分别为12.4mg/kg和385.5mg/kg），共8wk.采用酚红排空试验测定胃排空功能，计算排空率；用DCP-AES测定仪测定胃窦组织铁含量；RIA法测定胃窦组织环核苷酸cAMP和cGMP含量；组化染色显示胃窦肌间神经丛AchE和NOS，并应用彩色图像分析系统测定标本阳性物面密度.结果：IDA大鼠胃排空率为(90±10)%，显著大于对照组（78±9)%(P＜0.05）；胃窦组织铁含量为(30±9)μg/g，显著低于对照组（311±69)μg/g(P＜0.01）；胃组织上清液cAMP和cGMP浓度分别为(11.7±3.8)nmol/L和(2.0±0.7)nmol/L，均显著低于对照组（15.0±2.6)nmol/L(P＜0.05)；(2.8±0.4)nmol/L(P＜0.01），但cAMP/cGMP比值（5.8±0.2）,显著高于对照组（5.4±0.1)(P＜0.01）；胃窦肌间神经丛AchE面密度（11.8±1.2)%,显著低于对照组（13.9±1.6)%(P＜0.01），但其NOS面密度（10.8±1.6）%,显著高于对照组（9.5±1.0)%(P＜0.05）.结论：IDA大鼠胃排空功能亢进.缺铁可能通过影响Ach-cAMP,NO-cGMP信息传递，使cAMP/cGMP比值显著升高，导致胃平滑肌收缩功能亢进.
0 引言
缺铁（iron deficiency,ID）是当今世界上危及人类（尤其是儿童）健康的营养学问题之一，不仅能引起贫血，还可导致一系列非血液系统功能异常［1］.对缺铁性贫血（iron deficiency anemia,IDA）的胃肠道症状，我们［2］通过建立IDA大鼠模型，首次从小肠运动功能改变的角度进行了研究报道，并同步观察了其胃排空功能（gastric emptying function,GEF）改变，检测了胃窦组织的铁含量、环核苷酸水平及肌间神经丛NOS,AchE阳性神经面密度，以期对ID所致胃肠功能异常及其机制深入探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 4wk龄健康WISTAR大鼠60只（第三军医大学实验动物研究所提供），雌雄各半，随机分为IDA模型组（IDA组）和正常对照组（对照组）,各30只，按性别分离笼养，分别饲以低铁和正铁饲料（参考美国AOAC配方［3］,含铁量分别为12.4mg/kg和385.5mg/kg）.自由饮用去离子水，每周测体质量（BW）、Hb.8wk末IDA组Hb平均降至80.5g/L(67.8～98.3g/L)，禁食12h后开始实验.
1.2 方法 ①Hb测定：采用高铁氰化法.②GEF测定：采用酚红排空试验法.每组各取10只大鼠，每只灌服酚红糊剂（每mL含酚红0.1mg）2.5mL，信捷职称论文写作发表网，40min颈椎脱臼处死，剖腹取出胃肠，自幽门括约肌处剪下胃，将其内残留酚红充分溶于2mL去离子水，3500r/min离心15min，取上清于玻璃棉滤器过滤，滤液以日本日立200-20型分光光度计于λ/620nm处测吸光度为胃内色素残留量，求胃排空率［（灌入酚红吸光度－残留酚红吸光度）／灌入酚红吸光度×100％］，随后剪取胃窦测其铁含量.③胃窦组织铁含量测定：应用DCP-AES分析仪(美国Beckman公司产品）测定.④胃窦组织环核苷酸含量测定：参照文献［4］.每组各取10只大鼠，腹腔注射10g/L戊巴比妥钠2mL,麻醉后剖腹取胃窦，纵剖为2份（分别用作检测cAMP和cGMP），测cAMP部分称重后置入预冷的lmol/L高氯酸（l0mL/g），匀浆，2000r/min离心10min,取0.5mL上清液于试管内，200g/LKOH中和后，直接行RIA分析；测cGMP部分需先将cAMP与cGMP分开，即以阴离子交换柱（甲酸型Dowex1×8）吸附样品，再用不同浓度洗脱（交换下cAMP），减压、干燥后溶于反应缓冲液，再行RIA分析.试剂盒为中国军事医学科学院产品，标记物分别为3H-cAMP和3H-ScGMP，国产FJ-2008型液体闪烁计数仪测放射性.⑤胃窦肌间神经丛AchE和NOS组织化学染色和面密度测定：每组10只大鼠，参照文献［5］取出和固定胃窦，并分离出纵肌-肌间神经丛，标本置于0.01mol/LPBS（4℃）过夜；组化染色：AchE采用亚铁氰化铜法［6］，即标本用蒸馏水漂洗后，置于37℃孵育液60min，蒸馏水漂洗终止反应；NOS采用NADPH-d法［7］，即标本置于含下列试剂的PBS（pH8.0），37℃孵育45min：3g/LTritonX-100，0.5mmol／L硝基四唑氮蓝（Sigma产品），1.0mmol／Lβ－NADPH（Sigma产品），取出标本用0.01mol/LPBS漂洗终止反应.以上染色标本依次行裱片、晾干、脱水、透明和封片.图像分析应用CMIA007彩色图像分析系统（北京航空航天大学和空军总医院联合研制），于100倍光镜下每张片随机选3～5个视野，摄像并存入计算机，计算出每个标本阳性物面密度，即阳性物占统计场面积的百分比.
统计学处理：采用分组资料t检验（方差不齐者用平方根值代换，直至达到方差齐性要求）.
2 结果
IDA大鼠BW，Hb及胃窦组织铁含量的变化见Tab1.IDA大鼠胃排空率为(90±10)%，显著大于对照组(78±9)%(P＜0.05).IDA大鼠胃窦组织环核苷酸水平改变见Tab2.IDA大鼠AchE阳性神经面密度为(11.8±1.2)%,较对照组（13.9±1.6)%显著减少（P＜0.01）；NOS阳性神经面密度为(10.8±1.6)%，显著高于对照组（9.5±1.0)%(P＜0.05）.
讨论
对于IDA的胃肠道症状，以往多从外胚层组织、粘膜组织的缺铁及其所致的胃肠粘膜萎缩性病变加以解释［1］，我们也观察到IDA大鼠胃肠粘膜存在淋巴细胞浸润兼或萎缩，但程度较轻，可能与模型形成时间较短有关.结果还表明，IDA大鼠胃排空百分比显著大于正常大鼠，造模后期我们尚观察到部分IDA大鼠大便稀烂，次数增多，触摸其腹部时挣扎、尖叫程度都与对照组形成明显对比，这除了与其小肠收缩亢进乃至痉挛有关［2］外，还提示其胃部也存在同样情况，这可能能部分解释临床上IDA患者出现的呕吐、腹部绞痛和腹泻等症状.
环核苷酸cAMP和cGMP分别是Ach和NO的效应物质，能提高和降低平滑肌细胞内Ca2+水平，进而引起平滑肌的收缩和舒张.本研究中IDA大鼠的cAMP和cGMP较正常大鼠均显著降低，但cAMP/cGMP比值则显著升高，提示cGMP降低的幅度大于cAMP降低的幅度，使细胞内Ca2+水平升高，这可能是IDA大鼠胃平滑肌收缩功能亢进的分子学基础.
Ach和NO是胃肠组织中一对作用相反的终末性神经递质，前者呈兴奋性，后者呈抑制性，相互制约，相互协调，在正常生理情况下处于平衡状态，维持胃肠平滑肌的良好舒缩性［8］.Ach和NO分别通过提高效应细胞的cAMP和cGMP水平发挥作用，而AchE和NOS分别为反映Ach和NO水平的间接指标.本研究中IDA大鼠AchE较正常大鼠显著减少，而NOS显著性增多，似乎与以上结论矛盾.已知在鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase,GC）中，Fe2+构成其活性中心，NO与其结合并激活GC［9］，从而启动cGMP-Ca2+效应.本研究中IDA大鼠胃窦组织铁含量显著减少，故推断胃窦组织缺铁造成GC活性抑制，进而cGMP产生减少，另外在正常情况下细胞内Ca2+浓度过高时，通过激活NOS，启动NO-GC机制［10］，使cGMP水平升高,Ca2+水平下降，而维持平滑肌细胞的良好舒缩性.一旦GC活性抑制，这种反馈调节作用受限，则平滑肌处于过度兴奋状态.至于IDA大鼠NOS较正常大鼠增多，可能属一种代偿反应.
参考文献
1 秦振庭，王如文 主编.小儿血液病学. 第2版. 上海：上海科学技术出版社，1982:441-451
2 任文海，王新增，王振华et al．缺铁性贫血大鼠小肠推进功能的改变及其相关机制的研究.华人消化杂志，1998;6(12):1030-1032
3 Horwitz W. Official methods of analysis of the association of official analytical chemists. 14th ed.Washington: Association of Official Analytic chemists, 1984:880-882
4 李仪奎主编. 中药药理实验方法学. 第1版.上海：上海科学技术出版社，1991:260-264
5 王正品，周德山，蔡文琴. 大鼠小肠血管活性肠肽、p物质、亮氨酸－脑啡肽和生长抑素的正常分布.解剖学报，1989;20(1):68-72
6 陈啸梅主编. 组织学手册. 第1版.北京：人民卫生出版社，1982:172-175
7 Murad F, Forsterman U, Nakane M et al. The nitric oxide-cyclic GMP signal transduction pathway in vascular muscle preparations and other tissues. Jpn J pharmacol,1992;58 (Suppl 2):150-158
8 Schemann M, Schaaf C. Differential projection of cholinergic and nitroxidergic neurons in the myenteric plexus of guinea pig stomach. Am J physiol, 1995; 269(2):G186-G195
9 Graven PA, DeRubertis FR. Restoration of the responsiveness of purified guanylate cyclase to nitrosoguanidine, nitric oxide, and related activators by heme and hemeproteins: evidence for involvement of the paramagnetic nitrosyl. heme complex in enzyme activation. J Biol Chem, 1978; 253(23): 8433-8443
10 Busse R, Mulsch A. Calcium- dependent nitricoxide synthesis in endothelial cytosol is mediated by calmodulin. FEBS Lett, 1990; 265 (1):133-136
摘 要 目的：研究缺铁对大鼠胃排空功能的影响及其机制.方法：将4wk龄Wistar大鼠60只随机分为两组：缺铁性贫血（IDA）组和正常对照组，各30只，分别饲以低铁和正铁饲料（含铁量分别为12.4mg/kg和385.5mg/kg），共8wk.采用酚红排空试验测定胃排空功能，计算排空率；用DCP-AES测定仪测定胃窦组织铁含量；RIA法测定胃窦组织环核苷酸cAMP和cGMP含量；组化染色显示胃窦肌间神经丛AchE和NOS，并应用彩色图像分析系统测定标本阳性物面密度.结果：IDA大鼠胃排空率为(90±10)%，显著大于对照组（78±9)%(P＜0.05）；胃窦组织铁含量为(30±9)μg/g，显著低于对照组（311±69)μg/g(P＜0.01）；胃组织上清液cAMP和cGMP浓度分别为(11.7±3.8)nmol/L和(2.0±0.7)nmol/L，均显著低于对照组（15.0±2.6)nmol/L(P＜0.05)；(2.8±0.4)nmol/L(P＜0.01），但cAMP/cGMP比值（5.8±0.2）,显著高于对照组（5.4±0.1)(P＜0.01）；胃窦肌间神经丛AchE面密度（11.8±1.2)%,显著低于对照组（13.9±1.6)%(P＜0.01），但其NOS面密度（10.8±1.6）%,显著高于对照组（9.5±1.0)%(P＜0.05）.结论：IDA大鼠胃排空功能亢进.缺铁可能通过影响Ach-cAMP,NO-cGMP信息传递，使cAMP/cGMP比值显著升高，导致胃平滑肌收缩功能亢进.
0 引言
缺铁（iron deficiency,ID）是当今世界上危及人类（尤其是儿童）健康的营养学问题之一，不仅能引起贫血，还可导致一系列非血液系统功能异常［1］.对缺铁性贫血（iron deficiency anemia,IDA）的胃肠道症状，我们［2］通过建立IDA大鼠模型，首次从小肠运动功能改变的角度进行了研究报道，并同步观察了其胃排空功能（gastric emptying function,GEF）改变，检测了胃窦组织的铁含量、环核苷酸水平及肌间神经丛NOS,AchE阳性神经面密度，以期对ID所致胃肠功能异常及其机制深入探讨.
1 材料和方法
1.1 材料 4wk龄健康WISTAR大鼠60只（第三军医大学实验动物研究所提供），雌雄各半，随机分为IDA模型组（IDA组）和正常对照组（对照组）,各30只，按性别分离笼养，分别饲以低铁和正铁饲料（参考美国AOAC配方［3］,含铁量分别为12.4mg/kg和385.5mg/kg）.自由饮用去离子水，每周测体质量（BW）、Hb.8wk末IDA组Hb平均降至80.5g/L(67.8～98.3g/L)，禁食12h后开始实验.
1.2 方法 ①Hb测定：采用高铁氰化法.②GEF测定：采用酚红排空试验法.每组各取10只大鼠，每只灌服酚红糊剂（每mL含酚红0.1mg）2.5mL，信捷职称论文写作发表网，40min颈椎脱臼处死，剖腹取出胃肠，自幽门括约肌处剪下胃，将其内残留酚红充分溶于2mL去离子水，3500r/min离心15min，取上清于玻璃棉滤器过滤，滤液以日本日立200-20型分光光度计于λ/620nm处测吸光度为胃内色素残留量，求胃排空率［（灌入酚红吸光度－残留酚红吸光度）／灌入酚红吸光度×100％］，随后剪取胃窦测其铁含量.③胃窦组织铁含量测定：应用DCP-AES分析仪(美国Beckman公司产品）测定.④胃窦组织环核苷酸含量测定：参照文献［4］.每组各取10只大鼠，腹腔注射10g/L戊巴比妥钠2mL,麻醉后剖腹取胃窦，纵剖为2份（分别用作检测cAMP和cGMP），测cAMP部分称重后置入预冷的lmol/L高氯酸（l0mL/g），匀浆，2000r/min离心10min,取0.5mL上清液于试管内，200g/LKOH中和后，直接行RIA分析；测cGMP部分需先将cAMP与cGMP分开，即以阴离子交换柱（甲酸型Dowex1×8）吸附样品，再用不同浓度洗脱（交换下cAMP），减压、干燥后溶于反应缓冲液，再行RIA分析.试剂盒为中国军事医学科学院产品，标记物分别为3H-cAMP和3H-ScGMP，国产FJ-2008型液体闪烁计数仪测放射性.⑤胃窦肌间神经丛AchE和NOS组织化学染色和面密度测定：每组10只大鼠，参照文献［5］取出和固定胃窦，并分离出纵肌-肌间神经丛，标本置于0.01mol/LPBS（4℃）过夜；组化染色：AchE采用亚铁氰化铜法［6］，即标本用蒸馏水漂洗后，置于37℃孵育液60min，蒸馏水漂洗终止反应；NOS采用NADPH-d法［7］，即标本置于含下列试剂的PBS（pH8.0），37℃孵育45min：3g/LTritonX-100，0.5mmol／L硝基四唑氮蓝（Sigma产品），1.0mmol／Lβ－NADPH（Sigma产品），取出标本用0.01mol/LPBS漂洗终止反应.以上染色标本依次行裱片、晾干、脱水、透明和封片.图像分析应用CMIA007彩色图像分析系统（北京航空航天大学和空军总医院联合研制），于100倍光镜下每张片随机选3～5个视野，摄像并存入计算机，计算出每个标本阳性物面密度，即阳性物占统计场面积的百分比.
统计学处理：采用分组资料t检验（方差不齐者用平方根值代换，直至达到方差齐性要求）.
2 结果
IDA大鼠BW，Hb及胃窦组织铁含量的变化见Tab1.IDA大鼠胃排空率为(90±10)%，显著大于对照组(78±9)%(P＜0.05).IDA大鼠胃窦组织环核苷酸水平改变见Tab2.IDA大鼠AchE阳性神经面密度为(11.8±1.2)%,较对照组（13.9±1.6)%显著减少（P＜0.01）；NOS阳性神经面密度为(10.8±1.6)%，显著高于对照组（9.5±1.0)%(P＜0.05）.
讨论
对于IDA的胃肠道症状，以往多从外胚层组织、粘膜组织的缺铁及其所致的胃肠粘膜萎缩性病变加以解释［1］，我们也观察到IDA大鼠胃肠粘膜存在淋巴细胞浸润兼或萎缩，但程度较轻，可能与模型形成时间较短有关.结果还表明，IDA大鼠胃排空百分比显著大于正常大鼠，造模后期我们尚观察到部分IDA大鼠大便稀烂，次数增多，触摸其腹部时挣扎、尖叫程度都与对照组形成明显对比，这除了与其小肠收缩亢进乃至痉挛有关［2］外，还提示其胃部也存在同样情况，这可能能部分解释临床上IDA患者出现的呕吐、腹部绞痛和腹泻等症状.
环核苷酸cAMP和cGMP分别是Ach和NO的效应物质，能提高和降低平滑肌细胞内Ca2+水平，进而引起平滑肌的收缩和舒张.本研究中IDA大鼠的cAMP和cGMP较正常大鼠均显著降低，但cAMP/cGMP比值则显著升高，提示cGMP降低的幅度大于cAMP降低的幅度，使细胞内Ca2+水平升高，这可能是IDA大鼠胃平滑肌收缩功能亢进的分子学基础.
Ach和NO是胃肠组织中一对作用相反的终末性神经递质，前者呈兴奋性，后者呈抑制性，相互制约，相互协调，在正常生理情况下处于平衡状态，维持胃肠平滑肌的良好舒缩性［8］.Ach和NO分别通过提高效应细胞的cAMP和cGMP水平发挥作用，而AchE和NOS分别为反映Ach和NO水平的间接指标.本研究中IDA大鼠AchE较正常大鼠显著减少，而NOS显著性增多，似乎与以上结论矛盾.已知在鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase,GC）中，Fe2+构成其活性中心，NO与其结合并激活GC［9］，从而启动cGMP-Ca2+效应.本研究中IDA大鼠胃窦组织铁含量显著减少，故推断胃窦组织缺铁造成GC活性抑制，进而cGMP产生减少，另外在正常情况下细胞内Ca2+浓度过高时，通过激活NOS，启动NO-GC机制［10］，使cGMP水平升高,Ca2+水平下降，而维持平滑肌细胞的良好舒缩性.一旦GC活性抑制，这种反馈调节作用受限，则平滑肌处于过度兴奋状态.至于IDA大鼠NOS较正常大鼠增多，可能属一种代偿反应.
参考文献
1 秦振庭，王如文 主编.小儿血液病学. 第2版. 上海：上海科学技术出版社，1982:441-451
2 任文海，王新增，王振华et al．缺铁性贫血大鼠小肠推进功能的改变及其相关机制的研究.华人消化杂志，1998;6(12):1030-1032
3 Horwitz W. Official methods of analysis of the association of official analytical chemists. 14th ed.Washington: Association of Official Analytic chemists, 1984:880-882
4 李仪奎主编. 中药药理实验方法学. 第1版.上海：上海科学技术出版社，1991:260-264
5 王正品，周德山，蔡文琴. 大鼠小肠血管活性肠肽、p物质、亮氨酸－脑啡肽和生长抑素的正常分布.解剖学报，1989;20(1):68-72
6 陈啸梅主编. 组织学手册. 第1版.北京：人民卫生出版社，1982:172-175
7 Murad F, Forsterman U, Nakane M et al. The nitric oxide-cyclic GMP signal transduction pathway in vascular muscle preparations and other tissues. Jpn J pharmacol,1992;58 (Suppl 2):150-158
8 Schemann M, Schaaf C. Differential projection of cholinergic and nitroxidergic neurons in the myenteric plexus of guinea pig stomach. Am J physiol, 1995; 269(2):G186-G195
9 Graven PA, DeRubertis FR. Restoration of the responsiveness of purified guanylate cyclase to nitrosoguanidine, nitric oxide, and related activators by heme and hemeproteins: evidence for involvement of the paramagnetic nitrosyl. heme complex in enzyme activation. J Biol Chem, 1978; 253(23): 8433-8443
10 Busse R, Mulsch A. Calcium- dependent nitricoxide synthesis in endothelial cytosol is mediated by calmodulin. FEBS Lett, 1990; 265 (1):133-136
