1.3.2 淋巴细胞分离 抽取一健康成人10ml外周静脉全血并肝素化，Hanks液2倍稀释后按2：1的比例加入淋巴细胞分离液，室温2000rpm离心20min，吸取中间云雾状的淋巴细胞悬液，PBS漂洗2次，计数约107。
1.3.3 系列稀释和RT-PCR 将肿瘤细胞按10倍递减稀释成含细胞数105～100的混悬液，分别混入106个淋巴细胞中，抽提细胞总RNA，以后步骤和RT-PCR方法同1.2。
2 结果
2.1 肿瘤、对照样本 所有40例大肠癌患者的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织（胃溃疡和直肠腺瘤组织）RT-PCR产物经电泳均可见370bp的条带（图1），即表示有CK20 mRNA的表达；2例良性胃肠道病变的15个淋巴结RT-PCR结果均为阴性，而2例大肠癌患者的8个HE染色阳性淋巴结RT-PCR结果均为阳性（图2）。以上标本行GAPDH的RT-PCR产物均可见626bp的条带，证实RNA完整无降解。
图1 大肠癌和良性胃肠道疾病病变组织中CK20 mRNA的表达
M，分子量参照物(100bp DNA ladder)；1，胃溃疡组织；2，直肠腺瘤组织；3～7，4例大肠癌患者的肿瘤组织；B，不加RNA模板的空白对照：C，不加AMV酶的阴性对照。
图2 RT-PCR扩增良性胃肠道疾病淋巴结的电泳结果
M，分子量参照物；B，空白对照：Ad，直肠腺瘤组织； 1～3，直肠腺瘤患者的3个肠旁淋巴结；4～6，胃溃疡患者的4个胃小弯淋巴结。
不加RNA的反应体系作为空白对照进行PCR扩增结果为阴性；不加AMV反转录酶的反应体系进行PCR扩增结果为阴性，证实无基因组DNA的污染。
将存在CK20引物的RT-PCR产物进行测序，结果与Gene Bank检索所获得的序列一致，提示RT-PCR结果正确。
2.2 Dukes A、B期大肠癌患者的淋巴结样本 40例Dukes A、B期大肠癌的492个淋巴结，有17例（Dukes A期4例，Dukes B期13例）的53个淋巴结RT-PCR结果为阳性（图3），个数阳性率10.77 %，例数阳性率42.50%。以上所有标本GAPDH的RT-PCR均阳性，证实RNA完整无降解。
图3 1例Dukes 8期直肠癌患者8个HE染色阴性淋巴结RT-PCR产物的电泳结果
M，分子量参照物；T，肿瘤组织；B， 空白对照；C，不加AMV酶的阴性对照；1～4，直肠旁淋巴结，其中2个(1、3)检出微转移；5～8，直肠上动脉径路淋巴结，均阴性。
2.3 敏感性试验 系列稀释试验显示：随着淋巴细胞中所含肿瘤细胞数量的递减，CK20的RT-PCR产物电泳条带的亮度逐渐减弱直至消失，106个淋巴细胞中最少含101个肿瘤细胞时，电泳可见极弱的条带，即本试验的敏感性为105个淋巴细胞中可检测到1个肿瘤细胞存在（图4）。
图4 检测CK20 RT-PCR敏感性的系列稀释试验
从105～100按10倍依次递减的肿瘤细胞分别加入106个正常成人的外周血淋巴细胞。RT-PCR产物的电泳条带亮度逐渐减弱直至消失，101肿瘤细胞处可见极弱的条带；M，分子量参照物；0，仅含106个淋巴细胞，无肿瘤细胞；B，空白对照；T，仅含105个肿瘤细胞，无淋巴细胞。
3 讨论
在大肠癌的各种分期中，淋巴结转移与否具有重要的地位，它是判断大肠癌预后和指导术后化疗的重要指标。长期以来，临床上都采用单张病理切片HE染色判断淋巴结的转移情况。但仍有20%左右组织学证实淋巴结阴性的Dukes A、B期患者在术后5年内出现复发［1］，用连续切片法对阴性淋巴结进行重新检测，也发现近1/5的淋巴结存在转移［2］。因此，目前临床常规的病理组织学方法检出淋巴结转移的敏感性不够，不能发现微转移。
连续切片法可以提高淋巴结转移的检出率，但工作量过大，临床上难以推广。免疫组化从20世纪80年代中后期起开始用于淋巴结微转移的检测，CK、CC49等多种单抗被应用于检测［3～6］，尽管有助于检出微转移，但目前可供选择的抗体其特异性和敏感性还不能满足诊断的要求，能否作为推断预后的指标也存在争议［3～6］。作为一种形态学方法，它还存在阳性判断标准不一致的缺点，且切片的数量有限，不足以反映整个淋巴结的情况，费用也较高。因此，它也未能成为临床检测的常规手段。
近年来，随着分子生物学技术的发展，通过基因检测微转移已成为可能。目前基因检测主要是应用PCR技术，包括两方面的策略：一是检测肿瘤细胞基因突变或染色体重排所导致的DNA异常，报道的主要方法是突变等位基因特异性扩增（mutant allele-specific amplification，MASA）［7］，可检测的基因有K-ras和p53等，但此法最大的障碍在于K-ras和p53突变在大肠癌只占一部分，首先要检测原发肿瘤的突变类型，未测得突变者便不能进一步对淋巴结进行检测，所以检测率低，步骤也较复杂，目前不能用以临床。另一种策略是RT-PCR，它通过反转录并扩增正常被检组织不表达而肿瘤或肿瘤来源组织表达的mRNA以证实微转移的存在，即只要被检组织存在肿瘤或其来源组织的mRNA，就提示存在肿瘤细胞转移。
用于大肠癌淋巴结微转移检测的靶RNA主要包括CK和CEA等的mRNA，信捷职称论文写作发表网，本实验选择的是CK20。CK属细胞骨架蛋白，广泛分布于上皮细胞和上皮来源肿瘤细胞的细胞浆，在间叶组织不表达。CK共有20种亚型，CK20是其中之一，它在正常人体内的表达主要局限于胃肠道上皮［8］，而在正常淋巴结的淋巴细胞和上皮细胞不表达［9，10］。同时，CK20在几乎所有大肠癌组织中均表达［11］。与其他较常用的靶RNA比较，CK19在正常淋巴结上皮亦有一定表达，同时存在假基因的问题［3］；CEA虽作为肿瘤标志物被广泛应用，但在大肠癌的表达水平存在变异。因此CK20较两者具有更高的特异性，是目前较为理想的选择。同时，本实验选择的引物跨越了3个外显子，避免了RNA样品因基因组DNA污染和错配所造成的假阳性，从另一个角度保证了方法的特异性。从本实验的结果来看，所有40例大肠癌患者的肿瘤组织和2例良性胃肠道疾病的病变组织均表达CK20 mRNA，而2例良性胃肠道疾病的15个阴性淋巴结均不表达也证实了CK20的RT-PCR具有很高的特异性。
RT-PCR法具有很高的敏感性，只要存在极少量肿瘤组织的靶RNA，即可反转录并扩增获得阳性结果，通常可以在105～107个正常细胞（如淋巴细胞、外周血细胞或骨髓细胞等）中检出1个肿瘤细胞［9，10，12，13］。系列稀释试验也证明本实验体系能在105个正常淋巴细胞中发现1个肿瘤细胞。淋巴结样本的实验结果也表明，除HE染色阳性的8个淋巴结RT-PCR均为阳性外，原HE阴性的492个淋巴结中有17例的53个淋巴结RT-PCR为阳性，提示这些淋巴结中存在常规病理组织学检查所不能检出的微转移。这一点或许可能解释部分HE染色阴性的行根治术的大肠癌患者为何会出现复发。
通常，我们推断大肠癌患者的预后和选择术后的治疗方案主要是根据患者的分期，在国内普遍使用的是Dukes分期。Dukes分期的基本依据是肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移情况和远隔脏器的转移情况。但这些指标在指导治疗和判断预后等方面仍然存在着不足。比如说，Dukes A、B期的患者是指那些在术前、术中未发现有显性转移，术后的常规病理切片也未发现淋巴结转移的患者，我们能够对他们进行根治性手术，但这些患者依然有20%左右在术后5年内出现转移或复发，显然常规检查所谓的没有转移显然是站不住脚的，因此，根据常规检查所做出的分期也难以令人完全信服。而许多资料提示RT-PCR可以发现在这些患者的淋巴结、循环血液和骨髓等脏器中检出微转移［9，10，12，13］，既然原先的细胞病理的结果并不完全可靠，那么我们是否可以根据RT-PCR所得出的分子病理的结果取代原先细胞病理的结果对患者进行重新分期？将以上17例Dukes A、B期患者的分期改为Dukes C期？或者说这些患者是Dukes A、B期患者中的高危病例，应当进行更为积极的随访？是否也应该对发现微转移的
