作者：李羽，王军，徐哲，张岩，白雪帆
【关键词】 永生化
Immortalized hepatocyte transplantation for treating liver failure
【Abstract】 AIM: To study the roles of immortalized and primary human fetal hepatocyte intrasplenical transplantations in treating the rats with acute liver failure (ALF) induced by Dgalactosamine (Dgal). METHODS: ALF rats were induced by Dgal, and were divided into 3 groups. Rats of groupⅠreceived 2×107 immortalized human fetal hepatocytes intrasplenically; rats of group Ⅱreceived 2×107 primary human fetal hepatocytes intrasplenically; rats of group Ⅲ received 1 mL normal saline intrasplenically. All rats received Cyclosporin A(CsA) at 10 mg/kg im simultaneously. Then the survival rates, liver function and liver histology of all rats were observed. RESULTS: Survival rates of rats in groupⅠand Ⅱ were obviously higher than that of group Ⅲ (72.2% vs 22.2%, 61.1% vs 22.2%, P<0.01); the liver function and liver histology were also improved significantly as compared with those of group Ⅲ. Survival rate of group Ⅰ was close to that of groupⅡ (72.2% vs 61.1%, P>0.05). CONCLUSION: After human fetal hepatocyte transplantation intrasplenically, the survival rate of ALF rats intoxicated with Dgal is increased, and the liver function and histology are also improved. The immortalized hepatocytes would become the ideal cell material in the study of hepatocyte transplantation.
【Keywords】 immortalization; fetal hepatocytes; transplantation; liver failure, acute; Dgalactosamine
【摘要】 目的： 观察永生化胎肝细胞及胚胎肝细胞经脾脏移植对D氨基半乳糖（Dgal）诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法： 采用Dgal诱导大鼠急性肝衰竭，分3组进行治疗实验，Ⅰ组： 经脾脏移植永生化胎肝细胞2×107个；Ⅱ组： 移植原代胚胎肝细胞2×107个；Ⅲ组： 脾脏注射生理盐水1 mL，各组大鼠同时肌肉注射环孢霉素A(CsA) 10 mg/kg. 观察大鼠的存活率、肝脏功能、肝脏病理变化情况. 结果： Ⅰ组及Ⅱ组大鼠存活率均显著高于Ⅲ组大鼠（72.2% vs 22.2%, 61.1% vs 22.2%, P＜0.01），肝脏功能及肝脏病理均有改善, Ⅰ组与Ⅱ组之间大鼠存活率无明显差异(72.2% vs 61.1%, P＞0.05). 结论: 经脾脏移植胚胎肝细胞可明显改善Dgal诱导的肝衰竭大鼠的存活率，改善肝功能及肝脏病理，该永生化胎肝细胞可以成为肝细胞移植研究中的理想细胞材料.
【关键词】 永生化；胚胎肝细胞；移植；肝功能衰竭，急性；D氨基半乳糖
0引言
肝功能衰竭是各种肝脏疾病患者死亡的主要原因. 目前原位肝脏移植是挽救肝衰竭的惟一有效方法，但由于受到肝脏供源及手术费用等因素的限制，目前在我国广泛开展肝脏移植治疗肝衰竭仍面临许多困难. 肝细胞移植作为一种简便有效且对机体影响较小的技术愈来愈受到关注［1-5］，与肝移植相比，它具有以下优点： ① 一个供体可以给多个受体提供细胞；② 移植技术相对简单；③ 即使移植失败，对受体影响也十分微小. 肝细胞移植近年来得到较快发展，成为继原位肝移植后又一治疗各种肝功能衰竭的有效及有应用前景的方法［6-7］. 我们采用D氨基半乳糖(Dgal)诱导大鼠肝衰竭，经脾脏移植原代人胚胎肝细胞及自行建立的永生化人胎肝细胞治疗急性肝衰竭大鼠，观察急性肝衰竭大鼠在存活率、肝脏功能及病理等方面的变化，为临床开展肝细胞移植治疗提供依据.
1材料和方法
1.1材料永生化胎肝细胞由本室自行建立并保存，14～28 wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，成年雄性SD大鼠，体质量（105±23）g，由本校实验动物中心提供，实验室温20～25℃，实验前12 h禁食. DMEM培养基购自Gibco公司，IV型胶原酶购自Sigma公司，Dgal购于重庆医科大学.
1.2方法
1.2.1急性肝衰竭模型的建立Dgal以生理盐水配成10 mg/L液(pH 7.0)，按2.2 g/kg ip，建立大鼠急性肝衰竭模型.
1.2.2胎肝细胞的准备① 永生化胎肝细胞： 将冻存的胚胎肝细胞复苏，以终浓度1×105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM为培养基，其中含10 mL/L胎牛血清、10-9 mol/L胰岛素，视细胞生长情况每3～5 d换液1次，至细胞铺满瓶底，胰蛋白酶消化，0.4 g/L台盼蓝（Trypan Blue）染色判断细胞活率，计数后制成肝细胞悬液备用. ② 胎肝细胞的分离培养： 取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液（含0.01 g/L EDTA, 37℃, pH 7.4，信捷职称论文写作发表网，通以含950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混和气体）以20 mL/min的速度灌入，随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉. 灌注5 min至肝脏变色后改为含0.05 g/L胶原酶的Hanks液（37℃, pH 7.4，通以含950 mL/L O2, 50 mL/L CO2的混合气体）持续灌注5 min. 取下肝脏，置于含4℃ Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500 r/min清洗离心３次，每次２ min，弃上清，以4℃ Hanks液重悬，台盼蓝（Trypan Blue）染色判断细胞活率，计数后制成肝细胞悬液备用. 本研究肝细胞活率为91%，肝实质细胞纯度＞94%.
1.2.3肝细胞移植及分组92只大鼠在Dgal诱导肝衰竭48 h后随机分为3组，各组大鼠在相同饲养条件下，体质量、鼠龄均无显著差异. Ⅰ组： 30只，常规麻醉后切开腹腔，经脾尾穿刺在脾脏实质内注射浓度为2×1010/L 的永生化胎肝细胞悬液1 mL ，同时肌肉注射环孢霉素A(CsA)10 mg/kg. 其中18只用于观察2 wk存活率及组织学检查，12只用于抽血及组织学检查. Ⅱ组： 31只，脾内注射浓度为2×1010/L 的原代胎肝细胞悬液1 mL，其余处理同I组. 其中18只用于观察2 wk存活率及组织学检查，13只用于抽血及组织学检查. Ⅲ组： 31只，脾内注射生理盐水1 mL，随机选取18只用于观察2 wk存活率及组织学检查，13只用于抽血及组织学检查.
1.2.4肝脏功能测定各组分别于肝细胞移植或注射生理盐水后第l日、第3日、第7日，随即选取4只大鼠经腹主动脉抽血，用全自动生化分析仪测丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），总胆红素(TBi)，碱性磷酸酶(ALP).
1.2.5组织学检查取大鼠肝脏、脾脏标本，用10 g/L甲醛固定，按常规方法作苏木精伊红染色.
统计学分析： 所有数据以x±s表示，死亡率比较采用Fisher确切概率计算，各项肝功能指标组间比较采用方差分析及LSDt检验.
2结果
2.1实验鼠存活率比较实验鼠于药物诱导36 h后活动减少，嗜睡、有时呈激惹状态，48 h开始进入昏迷状态，部分伴尿失禁、口腔、泌尿生殖道出血，死亡时间大多在72 h～96 h之间. 大鼠2 wk存活率Ⅰ组为72.2% （13/18），Ⅱ组为61.1% (11/18)，Ⅰ组与Ⅱ组无明显差异(P>0.05)， Ⅲ组为22.2%(4/18)， Ⅰ组、Ⅱ组分别与Ⅲ组比较存活率均有显著提高（P＜0.01）.
2.2肝脏功能的检测Ⅲ组大鼠AlT, AST, TBi等指标在移植后第1日无明显改善，第3日肝功能异常达高峰，第7日有明显恢复. 在移植肝细胞后第1日，Ⅰ组与Ⅲ组各项指标差异无显著性(P>0.05),Ⅱ组与Ⅲ组亦无明显差异（P>0.05）. 第3日，Ⅰ组与Ⅱ组比较各项指标均有显著改善，与Ⅲ组相比差异显著(P<0.05). 第7日，肝功能均明显恢复，各组之间无显著差异(表1).
