【关键词】 食管肿瘤；肿瘤细胞；NDRG1基因；丁酸钠
0引言
丁酸钠是一种四碳脂肪酸盐，是重要的肠道黏膜营养剂. 研究证实丁酸钠能抑制胃癌、肝癌、结肠癌等肿瘤细胞增殖, 促进肿瘤细胞分化，改变瘤细胞形态结构及基因表达，诱导细胞凋亡［1-3］，因而丁酸钠作为一种极具潜力的抗癌药物越来越受到关注. NDRG1基因是一种与细胞分化有关的基因，升高其表达可抑制肿瘤细胞的增殖［4-5］. 我们采用MTT实验及流式细胞技术检测丁酸钠作用于食管癌EC9706细胞后细胞增殖和细胞周期的变化，并观察丁酸钠对NDRG1表达的影响，为丁酸钠用于食管癌诱导分化治疗提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料
食管癌EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室赠送. 丁酸钠（serva feinbiochemica heidelberg公司），RPMI 1640细胞培养基（Gibco BRL公司）,胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），羊抗人NDRG1多克隆抗体（Santa Cruz生物技术公司），丫啶橙(Sigma公司)，CO2孵育箱（美国Forma Scientific公司），流式细胞仪（德国Partec PAS公司），Fax?250酶标仪（英国Stat公司）.
1.2方法
1.2.1细胞培养
将人食管癌EC9706细胞单层贴壁生长于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，种植于含盖玻片的六孔板及75 cm2培养瓶中. 37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行试验.
1.2.2MTT实验
取对数生长期的EC9706细胞,调整细胞密度为7.5×107/L,按每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中. 设空白对照组和0.5 mmoL/L丁酸钠实验组,每组均设10个复孔. 实验终止前4 h向细胞液中加入MTT 20 μL,细胞被染色后以二甲亚砜200 μL溶解甲瓒颗粒,于酶标仪上测定A492 nm. 实验重复2次. 细胞抑制率= ［(A对照-A实验)/A对照］×100%.
1.2.3丁酸钠处理及细胞周期检测
用RPMI 1640培养液将丁酸钠调终浓度为0.5 mmol/L,对照组为不含丁酸钠的培养液. 取丁酸钠作用1, 3, 5 d的细胞爬片及对照组细胞爬片从六孔板取出后经pH 7.4的PBS冲洗，800 mL/L丙酮固定30 min后用中性树胶黏于载玻片上，4℃保存，用于免疫组化实验. 分别取丁酸钠作用1, 3, 5 d的细胞进行如下处理：培养瓶中的细胞经pH 7.4的PBS冲洗后加入2 g/L胰蛋白酶消化，离心后用预冷的PBS洗涤2次，加入700 mL/L乙醇1.0 mL固定细胞用于细胞周期测定. 上机前将细胞离心洗涤制成单细胞悬液,加丫啶橙染色,暗室放置,300目尼龙膜过滤,用流式细胞仪检测细胞周期分布.
1.2.4细胞免疫组织化学染色
采用SP试剂盒进行免疫组化实验. 按说明书步骤进行操作，DAB显色，苏木素复染，光镜观察细胞显色强度. 结果判定：在高倍镜下观察免疫组化着色情况，以信号强弱评定NDRG1表达的强弱.
统计学处理： 采用SPSS 11.0软件进行统计学处理，数据均采用x±s表示,检验水准α=0.05.
2结果
2.1MTT检测不同时间的各组平均吸光度值均低于对照组，其差异有显著性意义（P<0.05，表1）；随丁酸钠作用时间延长，其抑制率升高.表1丁酸钠对人食管癌细胞EC9706的增殖抑制作用确良（略）
2.2丁酸钠对食管癌细胞细胞周期的影响
实验组G1期细胞比例与对照组比较明显增高,而S,M期细胞比例减少，经统计学处理，差异有显著性意义（P<0.01,表2）.表2丁酸钠对食管癌EC9706细胞周期的影响（略）
2.3丁酸钠对食管癌细胞NDRG1蛋白表达的影响
免疫组化染色结果显示，信捷职称论文写作发表网，在作用1～5 d时，细胞胞质黄色着色较对照组明显加深，且随作用时间延长而增强（图1）.
3讨论
食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，食管癌的治疗方法除手术治疗、放疗等方法外，还有许多新的治疗方法，如基因治疗、免疫治疗、抗血管生成治疗、诱导分化治疗等［6］. 其中诱导分化治疗是肿瘤化学治疗的一个新领域. 诱导分化是指恶性肿瘤在体内外分化诱导剂存在下，细胞恶性行为降低，恶性表性发生改变，形态学趋于正常，呈现出向良性或趋向良性细胞分化的现象. 利用分化诱导剂可使肿瘤细胞部分或全部恢复分化潜能，转变为正常细胞或导致细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的.
我们的结果表明，丁酸钠作用1～5 d后细胞增殖的抑制率由17.4%增加到23.8%，表明丁酸钠可抑制食管癌细胞增殖，实验中增高丁酸钠浓度至1 mmol/L 2～3 d（结果未列出），可见培养的细胞死亡显著增多，说明其抑制率随丁酸钠浓度增加而升高；其增殖抑制作用与丁酸钠使食管癌EC9706细胞细胞周期发生变化有关，丁酸钠可使G1期细胞增加；S期细胞比例、M期细胞比例显著降低，从而使细胞增殖周期延长，导致细胞增殖减慢. 丁酸钠作用于食管癌EC9706细胞后， NDRG1的蛋白表达水平显著升高，而升高NDRG1基因表达可抑制结直肠癌细胞增殖，促进其分化［4-5］，因此丁酸钠对食管癌细胞的增殖抑制作用可能与NDRG1表达增加有关，NDRG1基因表达升高可促进p53基因介导的细胞增殖抑制和细胞凋亡过程［7］.
目前，丁酸钠对食管癌细胞NDRG1基因表达调控的机制尚不清楚. Guan等［8］研究表明, NDRG1的表达部分受DNA甲基化调控,同时三丁酸甘油酯、Trichostatin A(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)等对组蛋白去乙酰化酶有抑制作用的物质可诱导NDRG1的表达及许多不同类型细胞株的分化［9］. 丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可引起细胞核内多种变化，包括组蛋白的超乙酰化、DNA的甲基化及非组蛋白的修饰. 其中以组蛋白的超乙酰化最为重要，与基因表达和抑制细胞生长有关. 而组蛋白超乙酰化可导致DNA和组蛋白分离，使转录因子激活某些基因［10-11］. 丁酸钠可能是通过这种机制诱导NDRG1基因表达，进而抑制食管癌EC9706细胞生长，并诱导细胞分化.
【参考文献】
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