【摘要】 目的：探讨骨桥蛋白(OPN)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)后肺纤维化大鼠肺组织细胞因子的影响及机制。方法：SD大鼠随机分为对照组、模型组、干预组，每组40只。对照组腹腔注射生理盐水，模型组和干预组注入LPS(5mg.kg-1.d-1)，连续3d，干预组每次注入LPS后再注入抗OPN抗体，于给药后24h 及7、14、28d 处死3 组大鼠各10 只。HE、Masson 染色观察肺泡炎和肺纤维化改变；检测肺组织羟脯氨酸含量、NF-κBp65的表达、TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-10水平。结果：模型组肺泡炎及肺纤维化评分、羟脯氨酸含量、NF-κBp65表达、TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-10 水平较对照组显著升高(P<0.01)；与模型组相比，干预组肺泡炎及肺纤维化评分、羟脯氨酸含量、NF-κBp65表达及TNF-α、IFN-γ水平显著降低(P<0.05)，而IL-4、IL-10水平显著升高(P<0.05)。结论：OPN能加重LPS诱导的ALI后肺纤维化，机制可能与其促进NF-κB活化，改变炎性因子水平有关。
【关键词】 骨桥蛋白；急性肺损伤；肺纤维化；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；干扰素-γ；白介素-4；白介素-10
【中图分类号】 R2 【文献标号】A 【文章编号】2095-7165（2015）08-0013-03
Effect and mechanism of Osteopontin on cytokines in the pulmonary fibrosis after acutelung injury induced by lipopolysaccharide in ratsWANG Wen-jun, ZHANG Li, Li Duo,DAI Li, DENG Li-ping, FAN Xian-ming（Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China）Corresponding author: FAN Xian-ming, E-mail：fxm@163.comabstract:Objective :To observe the effect and mechanism of osteopontin (OPN) on cytokines in the pulmonary fibrosis after acute lung injury (ALI)induced by lipopolysaccharide (LPS) in rats. Methods:SD rats were randomly divided into control group, model group and treatment group, 40 rats ineach group. Rats were injected with normal sodium in control group, LPS solutionin in model group and treatment group for 3 days. Rats in treatmentgroup were injected with Anti-OPN antibody. 10 rats in each group were sacrificed at the 24 h, 7th, 14th and 28th day respectively. Alveolitis andpulmonary fibrosis were observed by HE and Masson staining．Hydroxyproline content，the expression of NF-κB p65，levels of TNF-α, IFN-γ,IL-4 and IL-10 in lung tissue homogenate were determined. Results:Compared with control group, the alveolitis and fibrosis score, hydroxyprolinecontent, the expression of NF-κB p65 and levels of TNF-α, IFN-γ, IL-4 and IL-10 were increased significantly in model group at the same timepoint (P<0.01). Compared with model group, the score of alveolitis and fibrosis, the hydroxyproline content, the expression of NF-κB p65, levels ofTNF-α and IFN-γ were decreased significantly, while levels of IL-4 and IL-10 were increased significantly in treatment group. Conclusion:OPN canaggravate the degree of pulmonary fibrosis after ALI induced by LPS, which might be related to promote the activation of NF-κB and change levels ofinflammatory cytokines.Key words:Osteopontin；Acute lung injury；Pulmonary fibrosis；Nuclear factor-B；Tumor necrosis factor-α；Interferon-γ；Interleukin -4；Interleukin -10
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)可引起弥漫性肺泡炎并在早期启动损伤修复过程，最终导致肺纤维化，促炎和抗炎细胞因子失衡在这一过程中起关键作用。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种多功能的非胶原性骨基质糖蛋白，参与了炎症反应和多种组织的纤维化过程。目前国内外对ALI后肺纤维化的研究较少，本研究旨在观察OPN 对ALI 后肺纤维化大鼠肺组织促炎因子TNF-α、IFN-γ及抗炎因子IL-4、IL-10的影响，并初步探讨其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性SD 大鼠，体质量（200±20）g，泸州医学院实验动物中心提供。LPS(美国Sigma 公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10) ELISA 试剂盒及兔抗大鼠OPN、NF-κBp65 抗体（美国Abzoom 公司）；羟脯氨酸测试盒（南京建成生物工程研究所）；胞核蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 及DAB 辣根过氧化物酶显色试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
1.1.1 诊断及辨证标准
1.2.1 动物分组与模型制备
120 只大鼠随机分为对照组、模型组、干预组，每组40 只。模型组和干预组在第0、1、2d 通过腹腔注射LPS 液(5mg.kg-1.d-1)，对照组注射等量生理盐水。干预组在每次LPS 注射5min后，再行腹腔注射抗OPN抗体(1:32)0.5ml，连续3d，而模型组及对照组用等量生理盐水代替。干预后24h及7、14、28d 分别处死每组大鼠10只。
1.2.2 标本采集
左下叶肺组织经10%福尔马林固定48h 后，在不同部位取材3块，乙醇脱水，石蜡包埋，切片后行HE 染色和Masson染色，进行肺泡炎及肺纤维化评分。留取大鼠左肺上叶及右肺组织制作肺组织匀浆待检。
1.2.3 肺组织羟脯氨酸含量测定
采用羟脯氨酸试剂盒（碱水解法）检测各组大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量。
1.2.4 Western blot检测肺组织匀浆细胞核NF-κB p65的表达提取肺组织匀浆中胞核蛋白，BCA试剂盒测定蛋白量，每个样品取50μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳分离，电转移到PVDF 膜上，3%BSA封闭液4℃封闭过夜；分别加入兔抗大鼠NF-κB p65 多抗(1：600)及内参兔抗大鼠Histone H1 抗体，室温孵育1h，PBST 洗2 次，加入抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1：10000)室温孵育1h，洗涤后加入显色试剂，凝胶成像分析系统摄像分析。
1.2.5 ELISA 检测肺组织匀浆中TNF-α、IFN-γ、IL-4 及IL-10水平严格按照试剂盒说明书进行，并用多功能酶标分析仪分析其浓度。
1.2.6 统计学分析使用SPSS13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，以P＜0.05代表差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况观察
注入LPS 后，模型组大鼠出现呼吸急促、口唇及四肢末端紫绀、活动减少等表现，而干预组上述表现有所减轻。
2.2 肺组织病理改变
对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡结构清晰，无明显的炎症细胞浸润，未见纤维化组织。模型组大鼠第24h可见肺泡壁水肿、增厚，炎症细胞浸润，肺泡腔内出血等肺泡炎改变，间质可见少许蓝色胶原纤维沉积；第7、14d 炎症细胞浸润逐渐减少，但蓝色胶原纤维进行性增加，部分肺泡间隔断裂；第28d肺泡炎最轻，纤维化最重，肺组织正常肺泡结构破坏，部分肺泡腔融合、闭陷，间质被大量蓝色胶原纤维占据，形成弥漫纤维化。干预组肺纤维化进程与模型组相似，但病理表现在各时间点均较模型组减轻。与对照组相比，同一时间点模型组及干预组的肺泡炎及肺纤维化评分均明显升高（P<0.01）；但在同一时间点，干预组的肺泡炎及肺纤维化评分均明显低于模型组（P<0.05）。见图1-3。
2.3 肺组织羟脯氨酸含量比较
模型组大鼠肺羟脯氨酸含量呈进行性增加，第28d 含量最高。同一时间点模型组和干预组羟脯氨酸含量均明显高于对照组（P<0.01），干预组羟脯氨酸含量在同一时间点低于模型组（P<0.01）。见表1。
注：同一时间点，与对照组比较，aP<0.01，与模型组比较，bP<0.05
2.4 肺组织匀浆TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-10比较各时间点，模型组和干预组大鼠肺组织匀浆TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-10含量均较对照组显著升高（p<0.01），以第24h 最高，其后呈下降趋势，第28d 最低。与模型组相比，干预组TNF-α 及IFN-γ含量在各时间点均明显下降（p<0.05）；而IL-4及IL-10 含量在各时间点均明显升高（p<0.05）。见表2。
注：同一时间点，与对照组比较，aP<0.01，与模型组比较，bP<0.05
2.5 肺组织匀浆细胞核NF-κBp65的表达各时间点，模型组和干预组大鼠肺组织匀浆细胞核NF-κBp65表达均较对照组明显升高（p<0.01），但干预组明显低于模型组（p<0.01）。见图4、表3。
3 讨论
ALI的本质是肺内失控的炎症反应，早期以肺泡炎改变为主，后期发展成肺纤维化。本研究结果显示模型组大鼠早期出现炎症细胞浸润、肺泡腔内出血、炎性因子表达增加等肺损伤改变，肺泡炎评分升高；随时间推移，出现肺泡腔融合、广泛胶原纤维沉积及羟脯氨酸含量增加等肺纤维化改变，肺纤维化评分升高，符合ALI 后肺纤维化的动态演变过程，提示模型复制成功。在ALI 的早期即可出现成纤维细胞增生和胶原分泌增强，炎症和纤维化过程紧密重叠。Marshall[1]等发现ARDS患者在24h即已出现BALF 中Ⅲ型胶原增加等纤维增殖反应，本实验同样发现模型组大鼠24h 肺部就有蓝色胶原沉积，羟脯氨酸含量增加，说明LPS诱导的ALI后肺纤维发生在非常早的阶段。TNF-α 能通过与多种炎症细胞表面的受体结合正反馈放大炎症反应，并且可损伤肺泡上皮及血管内皮细胞、激活凝血系统、破坏肺表面活性物质等而导致或加剧ALI [2]。IFN-γ 可以提高TNF-α、IL-8等炎症因子的表达，促进巨噬细胞分泌促炎因子，级联放大炎症信号，使炎性反应失衡引起组织损伤[3]。IL-4 和IL-10是人类免疫反应过程中重要的Th2型抗炎细胞因子，能抑制单核细胞核巨噬细胞分泌IL-6、IL-1、巨噬细胞炎性蛋白质-1等前炎症细胞因子，还能抑制NF-κB的活性，下调炎症反应，抑制肺纤维化[4]。本研究显示，模型组大鼠各个时间点肺组织匀浆TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-10含量均较对照组升高，提示上述因子不仅参与了ALI早期的肺泡炎症反应，也参与了随后的肺纤维化过程。与模型组相比，干预组TNF-α、IFN-γ 表达降低，IL-4、IL-10 表达升高，而肺泡炎及肺损伤评分降低，提示抗OPN抗体可能通过上调抗炎因子下调促炎因子表达，抑制肺泡炎症损伤，从而减轻肺组织的异常修复所致的纤维化。模型组IL-4及IL-10 表达较对照组升高，这可能是对ALI 炎症控制的一种保护性反应。
NF-κB是一种核转录因子，可调控多种细胞因子的表达。LPS能激活NF-κB，活化的NF-κB 能上调ICAM-1、VCAM-1等基因促进炎症细胞浸润，也能促进TNF-α、IL-8 等炎症因子表达，扩大炎症反应，加重肺损伤[5]。同时NF-κB有促进肺成纤维细胞活化、启动致纤维化细胞因子的基因转录及调节胶原合成的作用，拮抗NF-κB活性能减轻肺纤维化的程度[6]。OPN是一种多功能促炎因子，在炎症反应、组织损伤及修复中起重要作用，前期资料表明OPN能通过多种途径调控NF-κB 的活性，导致大量炎症因子产生[7]。在本研究中，各时间点模型组大鼠肺组织匀浆细胞核NF-κBp65 表达均较对照组明显升高，提示活化的NF-κB 参与了LPS 诱导的ALI和肺纤维化全过程。使用抗OPN抗体后，各时间点细胞核NF-κBp65表达降低，相应的TNF-α、IFN-γ表达下降，而抗炎因子IL-4、IL-10 表达升高，提示OPN 可能通过促进NF-κB 活化，上调促炎性因子表达，改变炎性因子水平，加重LPS诱导的ALI后肺纤维化。综上所述，OPN能加重LPS 诱导的ALI 后肺纤维化，其机制可能与OPN促进NF-κB活化，改变炎性因子水平有关。早期使用抗OPN抗体对LPS诱导的ALI后肺纤维化有一定的治疗作用。
