木犀草素，多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高。具有镇咳和祛痰作用。据最新研究，呼吸道症状咳嗽、咳痰、喘息，均与气道慢性炎症有关。如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、慢性咽炎、变应性鼻炎等引起咳嗽、咳痰、喘息，均被认为与局部的炎症浸润有关，炎症的存在，使得气道的免疫应答混乱，患者常出现气道反应性增高。

　　[摘要] 探讨木犀草素(luteolin，Lut)对对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导的L02肝细胞损伤的保护作用。CCK8法检测Lut对L02细胞活性的影响;筛选APAP诱导L02细胞损伤的浓度及作用时间;细胞形态学、CCK8实验和流式细胞术检测分析Lut对APAP诱导的L02细胞凋亡的影响;比色法检测细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活性;RTPCR检测凋亡相关基因Bax，Bcl2，caspase3的表达。结果显示Lut在2.5～40 μmol・L-1不影响L02细胞活性;12 mmol・L-1 APAP作用于L02细胞12 h可用于建立肝细胞损伤模型。与模型组相比，Lut组细胞状态明显改善，胞体增大，贴壁能力恢复明显;细胞凋亡率明显下降;MDA含量显著下降(P<0.05或P<0.01)，GSH和SOD活性显著提高(P<0.05或P<0.01)，同时能够上调Bcl2及下调Bax，caspase3 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。该实验证明了Lut对APAP诱导的L02细胞损伤有保护作用，其机制可能与其减轻氧化应激反应和抑制细胞凋亡有关。

　　[关键词] 木犀草素; L02细胞; 氧化应激; 细胞凋亡; 对乙酰氨基酚

　　对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是一种常见的解热镇痛药，APAP在治疗剂量下安全，但过量使用会造成急性肝损伤[1]。APAP过量服用在许多国家已成为故意或意外死亡的原因之一[23]。目前，有证据证实细胞内氧化应激是APAP引起急性肝损伤的重要生物学机制之一[47]，因此，探讨能够有效预防或缓解APAP引起的急性肝损伤途径具有积极的临床意义。

　　木犀草素(luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金银花、紫苏叶等植物中，近年研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用[811]。本文通过预防性给药，研究给药后氧化应激损伤相关生理指标变化，探讨Lut的细胞保护和抗凋亡作用，为对乙酰氨基酚肝损伤的防治提供进一步的实验依据。

　　一、材料

　　1.1 细胞 正常人肝细胞株(L02)为本实验室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37 ℃，5% CO2且饱和湿度条件下进行常规培养。

　　1.2 药品与试剂 DMEM(高糖)培养基购自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素均购自GIBCO公司;Cell Counting Kit8 (CCK8)购自东仁化学科技(上海)有限公司;木犀草素(luteolin，Lut)、五味子乙素(schizandrin B，Sch B)均购自成都普菲德生物技术有限公司;APAP购自中国食品药品检定研究院;AnnexinVFITC/PI试剂盒购自Sigma公司;谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;逆转录和PCR反应试剂盒购自Thermo Fisher Scienfitic公司;Bax，Bcl2，caspase3引物均购自Invitrogen公司。

　　1.3 仪器 酶标仪( BioTek Synergy H1 H1MFD，美国);DMIL HC型倒置相差显微镜(Leica，德国);流式细胞仪(BD FACS Canto Ⅱ)。

　　二、方法

　　2.1 细胞培养 L02细胞培养按照常规培养的方法，含10%胎牛血清、100 kU・L-1青霉素和100 g・L-1链霉素的DMEM(高糖)培养基，37 ℃，5% CO2培养箱培养。

　　2.2 CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响 将L02细胞以7×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，接种12 h细胞全部贴壁后，分别给予0，2.5，5，10，20，40，80，160 μmol・L-1的Lut，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔。在37 ℃，5% CO2的培养箱中培养8 h后CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%，式中Ac为对照孔吸光度，As为实验孔吸光度，Ab为空白孔吸光度。

　　2.3 APAP诱导L02细胞肝损伤模型的建立 将浓度为7×104个/mL的L02细胞接种到96孔板，每孔100 μL，接种12 h细胞全部贴壁后，设0，6，12，18，24，30 mmol・L-1浓度梯度的APAP进行造模，实验设阴性对照孔和空白对照孔，每个浓度设3个复孔，分别在造模3，6，12，24，48 h后弃上清液，用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。

　　2.4 Lut对APAP诱导L02细胞损伤的影响 实验分6组，分别是对照组、模型组(APAP，12 mmol・L-1)、3个实验组(Lut，浓度分别为2.5，5，10 μmol・L-1)和阳性对照组(五味子乙素[12]，Sch B，5 μmol・L-1)。取对数生长期L02细胞，调整细胞数为7×104个/mL，接种于96孔板中，37 ℃，5% CO2培养箱中培养12 h，实验组和阳性对照组更换为相应的含药培养液，对照组和模型组更换新的完全培养液，继续培养8 h后，除对照组外，其余各组加入APAP 12 mmol・L-1造模，造模12 h，于倒置显微镜下观察细胞形态后弃上清液，用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。

　　2.5 AnnexinV FITC/PI双标记法检测细胞凋亡 将L02细胞按照1×105个/mL 接种到6孔板中，每孔2 mL，分组、给药及造模同2.4项，造模12 h后，将L02细胞消化下来，按照Annexin VFITC/PI说明书方法对细胞进行染色，利用流式细胞仪检测L02细胞凋亡情况。

　　2.6 培养液MDA，GSH及SOD水平的检测 将L02细胞按照1×105个/mL 接种到6孔板中，分组、给药及造模同2.4项，造模12 h后收集细胞培养上清，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测细胞培养上清中MDA含量、GSH及SOD活性。

　　2.7 RTPCR检测Bcl2，Bax和caspase3 mRNA表达 分组、加药及造模同2.2项。每组设3个复孔。造模12 h后收集细胞，应用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以βactin为内参进行扩增，检测细胞中Bcl2，Bax和caspase3 mRNA的表达量。Bcl2，Bax和caspase3 引物序列见表1。实验操作按试剂盒说明书进行。

　　2.8 统计分析 所有数据均采用SPSS 17.0应用软件进行统计学分析。计量资料数据用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　三、结果

　　3.1 CCK8检测Lut对L02细胞活性的影响 为了寻找合适的Lut反应浓度，本实验考察了Lut(2.5，5，10，20，40，80，160 μmol・L-1) 对L02细胞活性的影响。研究发现Lut浓度在2.5，5，10 μmol・L-1时活性最强，故本实验采用2.5，5，10 μmol・L-1的浓度梯度进行后续试验，见图1。

　　3.2 APAP诱导L02细胞损伤模型的建立 本研究首先考察APAP浓度和刺激时间对L02细胞损伤的影响，结果显示随着APAP浓度的增加，L02细胞的存活率逐渐降低;随着造模时间的延长，相同APAP浓度下的L02细胞的存活率逐渐降低。综合考虑造模时间和造模浓度，以IC50为原则，实验中12 mmol・L-1APAP造模12 h的抑制率为(49.64±3.30)%，因此，本研究选择造模时间为12 h和造模浓度为12 mmol・L-1的APAP进行后续试验，见图2。

　　3.3 Lut对APAP诱导L02细胞损伤的影响 形态学观察发现，对照组细胞生长良好、背景清晰，细胞贴壁牢固，单个细胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均匀;模型组(APAP，12 mmol・L-1)细胞出现明显的凋亡，细胞数量减少，胞体缩小呈圆形。与模型组相比，Lut组和阳性药五味子乙素(Sch B)中的细胞状态明显改善，贴壁能力恢复明显，胞体增大，多数细胞呈梭形。从L02细胞形态变化上可见，Lut 在一定程度上可显著减轻APAP的损伤作用，提高细胞存活率，表明Lut对APAP损伤的L02细胞具有一定的保护作用，见图3。

　　CCK8检测结果显示，模型组中细胞存活率显著降低(P<0.01)，约为对照组的50%，Lut组(2.5，5，10 μmol・L-1)和Sch B组细胞活力较模型组均有升高的趋势(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1 Lut组效果最为明显，表明Lut对于APAP诱导的细胞损伤具有保护作用，这与细胞形态学结果一致，见图3。

　　3.4 Lut 对L02细胞凋亡的影响 凋亡流式检测结果显示，与对照组相比，模型组(APAP，12 mmol・L-1)细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与模型组相比，Lut组(2.5，5，10 μmol・L-1)凋亡率显著降低(P<0.05或P<0.01)，其中10 μmol・L-1Lut组效果最为明显，见图4。结果表明，Lut可显著抑制APAP诱导的L02细胞凋亡。细胞凋亡率=早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率。

　　3.5 木犀草素对APAP诱导的L02细胞中MDA，GSH及SOD的影响 实验结果显示，与对照组相比，APAP组MDA含量明显升高，而GSH和SOD活性明显降低(P<0.05或P<0.01);与模型组相比，不同浓度的Lut及Sch B可明显降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，同时明显提高GSH和SOD活性(P<0.05或P<0.01)，其中10 μmol・L-1 Lut组效果最为明显，见表2。

　　3.6 Lut对凋亡相关基因Bcl2，Bax和caspase3表达的影响 实验结果显示，与对照组相比，APAP组Bax和caspase3 mRNA表达明显升高(P<0.01)，同时Bcl2 mRNA表达明显降低(P<0.01);与模型组相比，Lut组Bax和caspase3 mRNA表达明显降低(P<0.05或P<0.01)，同时Bcl2 mRNA表达明显升高(P<0.05或P<0.01)，尤以10 μmol・L-1Lut组效果最为明显，提示Lut具有明显的抑制L02细胞凋亡的作用，见表3。

　　四、讨论

　　近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用。本研究通过建立APAP诱导的肝损伤模型，探讨Lut对APAP诱导的L02细胞损伤的保护作用。APAP 诱导建立的肝损伤模型是目前较为常用的肝损伤模型，此模型造模时间短、易复制、稳定性好，是筛选保肝药物的理想模型[1315]。本实验发现，APAP(12 mmol・L-1)能明显抑制L02细胞活性，Lut干预后，与模型组比较，L02细胞活性明显改善，其中10 μmol・L-1 Lut的药效最为明显。

　　氧化应激在APAP诱导的肝损伤中起着重要作用[16]。MDA是脂质过氧化反应的产物，其高低常常可以反映脂质过氧化的程度，间接反映出细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是平衡机体氧化与抗氧化的关键酶，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。SOD活性也是判断细胞损伤程度的相关指标。GSH可直接通过供H+拮抗氧自由基毒性，清除体内的超氧离子及其他自由基，防止肝细胞损伤。GSH 是机体内最重要的非酶性抗氧化物，其水平的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。因而本实验测定三者水平来反映细胞氧化应激水平。本研究显示，与模型组相比，Lut组氧化指标MDA含量明显降低，抗氧化指标GSH和SOD活性则显著提高(P<0.05或P<0.01)，研究初步表明木犀草素可通过减轻氧化应激反应而达到抑制APAP诱导的肝损伤。