2.1.2 产目标中药功效成分的新合成路径的创建 这种模式是基于对所需合成的目标产物或其中间体的化学结构了解比较清楚的情况下，在底盘细胞中对中药功效成分或中间体的合成路径进行重新设计，然后根据这条路径从基因数据库中筛选出与目标产物合成有关联的酶基因，将这些酶基因导入受体细胞中，在底盘细胞中进行组装、表达，从而构建出一条全新的、与原植物中的合成路径相差很大的合成路径。采用这种模式构建的代谢途径与原底盘细胞中固有的代谢途径相差比较大，不需要对代谢途径有太深入的了解。上述1.5项中红景天苷和淫羊藿苷的合成都是这一方式的典型案例。

　　2.2 对中药功效成分合成路径计算机模拟设计

　　当选定要生产的目标产物时，首先要确定该产物的最优合成途径。伴随着新一代的测序技术以及生物信息学分析技术的发展为合成路径的发现提供了一个新的选择，即参考代谢流分布，设计一些启发式的假设(如菌体最大生长量、产物最大合成量等)，进行通量平衡分析(FBA)，最小代谢调整分析(MOMA)等in silico分析方法，通过各种各样的依靠大规模的细胞代谢模型其他工作对细胞代谢进行系统的模拟操作，通过计算机模拟出最高的物质产出(流平衡分析)，确定最优的合成途径。目前，化学计量的基因组尺度代谢模型是最常用的一种模型，它能够对整体代谢网络进行深入的思考以及对如何将中央路径引入到其他细胞的新陈代谢中[45]。

　　最早最简单的关于化学计量模型(基因尺度或非基因尺度)是发现产品的最大理论产量和最高产量的中代谢的流量分布。Opt Strain算法可以搜索反应数据库，找到可以添加到网络提高理论产量额外的反应。这些方法已经取得了巨大的成功，例如二氢青蒿酸的生产[46]。Alper等[47]通过应用MOMA方法，鉴定并通过实验证实了缺失7个基因的E.coli JE660菌株中番茄红素的合成量显著提高(比原菌株高约40%)，成功完成了对大肠杆菌中能够改善番茄红素合成量的靶基因位点的预测及鉴定工作;2011年，Song等[48]利用基因组规模代谢网络和流量平衡分析，确定2个氨基酸和4个维生素作为必要化合物补充到培养基中，将改善曼琥珀酸的产量(比原培养基中提高15%)。Sun等 [49]提出了一种基于约束条件，通过计算机模拟生物可达到的最佳反应速率，基于模拟结果，确定能够改善萜类物质潜在的敲除位点，结果表明，相比野生型，大多数单突变体产生紫穗槐二烯的产率增加8～10倍。

　　2.3 对所创建的代谢途径的优化调控

　　将基因导入到底盘细胞后，需要对其所产生的一系列不良反应[5055]，采取一定的应对措施进行优化调控。第一个要解决的障碍是确保导入基因的协调表达，异源合成途径导入过程往往会打破微生物在长期的自然进化过程中所形成的代谢方式，破坏细胞内基因表达的动态平衡，造成上下游途径的不适配性，引起中间代谢物尤其是有毒中间代谢物的大量积累，造成细胞毒性，严重影响细胞的正常生长，致使目标产物无法高效合成[50]，同时也会影响细胞自身的生长繁殖[51]。这可以通过正确选择包括启动子的调节组分和转录终止子，以及核糖体结合位点，分别控制转录和翻译速率;另一方面，由于底盘细胞无法自发的对外源基因的表达进行调控，因此还会诱发一系列的不良反应如严谨反应，热激反应，压力反应等[5254]，而这些不良反应又会造成细胞的多种改变如质粒不稳定，细胞裂解以及遗传信息的改变等[55]。为了避免这些因素对产物合成的影响，必须对所构建的工程菌株进行优化。

　　2.3.1 启动子 一般来讲，协调多基因表达最常用的方法就是采用不同的启动子对不同的基因分别进行调控。目前常用的启动子分为2类：组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是一类可以在保持下游基因持续表达的启动子，并且不需要任何诱导剂，其表达系统最为经济简便，对于比较低廉的化学品以及药物来说，使用组成型启动子可以节约成本。但是过早的表达产物会对细胞造成毒害作用，影响宿主细胞的生长，甚至会导致宿主细胞的死亡。因而，在利用工程菌生产中药功效成分时，大多用的还是诱导型启动子，这也是协调多基因表达最直接，最简单的方法。Van Dien S J等[56]在大肠杆菌中用Ptac启动子控制大肠杆菌多聚磷酸盐激酶(PPK)的表达，同时用另一诱导型启动子PBAD对聚磷酸酶(PPX)基因的表达进行调控，通过在菌株的不同生长时期添加不同的诱导剂，对两基因在不同的时期进行表达实行了简单的调控。但在实际运用中，诱导型启动子只能对基因的表达起到粗略的调控，即对所控制的基因实行全部开启或全部关闭，而不能实现对基因表达的精细调控;另一方面，诱导型启动子的数量以及诱导剂之间的相互干扰也极大的限制了这一方法的大规模应用。针对这一问题，科学家们首先想到的是对启动子进行改造，即应用启动子工程，构建出能够满足不同表达强度需求的启动子库。ReddingJohanson等在构建产倍半萜烯紫山槐4，11二烯的大肠杆菌工程菌株时，甲羟戊酸激酶(MK)和磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)2种蛋白质的表达水平非常低。为了克服这一瓶颈，对MK和PMK基因进行密码子优化以及替换强启动子，这些变化显著提高了紫山槐4，11二烯的产量(4 500 mg・L-1)[57]。另外就是通过筛选得到能够响应同一诱导物的具有不同表达强度的诱导型启动子，从而避免不同诱导剂之间的相互干扰，如Ajikumar等[25]利用代谢工程多元模块法生产紫杉醇二烯实验中，上游模块就是由Trc启动子控制MEP途径的4个关键酶基因(dxs， idi，ispD和ispF)。但该方法所能利用的启动子库非常少。

　　2.3.2 建立动态平衡 在合成路径的构建往往会增加几个数量级的前体途径的代谢流，即使是细胞本源的代谢路径，也会使酶活性水平的失衡，导致代谢物浓度的巨大波动。例如，在利用酵母中异戊二烯途径产青蒿素过程中，会有2个中间体在这个途径导致细胞生长抑制，一是HMGCoA，它会在脂肪酸生物合成路径中导致反馈抑制，这是由于它和malonylCoA的相似性所导致的;一个是倍半萜的直接前体物质法呢基焦磷酸(FPP)。而FPP代谢流需要很大才能满足萜类物质大量合成的要求，当下游途径的表达模块与FPP供应量不能相协调时，FPP的积累会造成细胞毒性，对细胞生长造成威胁，同时，目标产物的合成也受到影响。针对这一问题，Dahl等[58]将来源于大肠杆菌的对FPP压力起负调控的启动子被用来调控上游乙酰辅酶A硫解酶(atoB)，而对其起正调控启动子被用来调控下游ads的表达，通过设计紫槐二烯途径以及甲羟戊酸途径的动态回路，成功促进了紫槐二烯的合成;Yuan等[59]利用实时定量PCR对酿酒酵母中基因的表达进行了探究，发现当细胞中麦角固醇积累时，羊毛甾醇14α去甲基化酶(ERG11)、C8甾醇异构酶(ERG2)、C5 甾醇去饱和酶(ERG3)这3个基因的表达是下调的，并对调控这些基因的启动子进行了鉴定，利用这些响应启动子对ERG9的表达进行调控，萜类合成量提可高2～5倍。

　　2.3.3 操纵子策略 在原核生物中，多个相关基因在表达是往往会被组合成一个操纵子，而操纵子基因之间的序列能够直接影响mRNA的加工以及稳定性。合成生物学运用这一特性，用一个启动子对多个基因进行表达进行调控。Pfleger等通过改变基因间的区域(tunable intergenic regions，TIGRs)这一方法，成功实现了对同一个操纵子中多个不同基因的精确调控。该方法通过构建包含mRNA二级结构、RNA酶切位点以及核糖体结合位点的TIGRs库，对这些调控元件进行适当的组合，得到最优化的DNA序列，Pfleger等利用该方法，对大肠杆菌中异源的甲羟戊酸途径中的3个基因的表达量进行了平衡调控，最终，甲羟戊酸产量提高了7倍[60]。

　　2.3.4 支架蛋白 支架蛋白是存在于生物信号转导系统中的一种不具备酶活性的蛋白质，能同时将2个或多个功能相关的蛋白质结合在一起，从而保证了信号传递的特异性和高效性。以该理论为基础，通过人工设计支架蛋白，对代谢途径中相关酶进行优化和改造，把功能相关的酶形成可控的复合体，通过对代谢途径中基因表达的精密调控，在提高底物的有效浓度的同时，解决细胞毒性以及代谢压力的问题，最终达到提高底物转化效率的目标。Keasling实验小组[50]根据大肠杆菌工程菌中所构建的甲羟戊酸途径，设计构建了一个由3个不同配基组成的支架蛋白，同时对该途径中的3个合成酶atoB、羟甲基戊二酰CoA合酶(HMGS)、HMGR添加了相应的配体，通过改变支架蛋白上配基的数量来改变着3个酶的化学计量数，从而达到平衡代谢流、减少细胞负荷的目的，同时甲羟戊酸生产浓度提高了77倍。虽此方法可以对代谢流进行精密高效的控制，但自然界中的支架蛋白只存在于其固有的信号途径中，而对其进行设计及改造十分局限，实施起来难度较高，目前成功的例子很少。

　　三、展望

　　中药功效成分的获取，无论是从中药中提取，还是化学合成、半化学合成以及一些其他方法等，这些方法都有很大的局限性，同时无法满足人类对中药功效成分的需求。合成生物学方法利用微生物易于培养等特点生产中药功效成分，为其可持续利用提供了一个新的可行的方法。虽然合成生物学起步较晚，但发展迅猛，各种高效、简便的生物学技术也相继诞生，如高通量测序技术、不同尺度的DNA组装技术以及一些文库，如启动子文库、核糖开关文库等的建立，都极大的推动了该方法的发展。通过合成生物学技术，利用微生物发酵来进行中药功效成分的异源合成已经取得的一系列成果，如青蒿素、人参皂苷、丹参酮等的生物学合成，尤其是青蒿素的生物合成方面更是显示出了其在中药功效成分合成方面的巨大优势和潜力，为中药领域的开发注入了新的活力。