[论文关键词]心肌梗死；内皮祖细胞；CXCR4

    [论文摘要]目的 观察急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者外周血来源内皮祖细胞(endothelial progentior cells，EPCs)CXCR4受体表达及功能的变化。方法 选择AMI患者15例，对照组非AMI患者15例，抽取外周血密度梯度离心法获取单个核细胞，培养7 d后对贴壁的细胞进行分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝集素I和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为EPCs。应用改良的Boyden小室测定EPCs对基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derivedfactor-1，SDF-I)的迁移能力，流式细胞仪测定EPCs的CXCR4的表达，RT-PCR法测CXCR4的mRNA表达。结果 AMI患者外周血EPCs数目增多，对SDF-1的迁移能力增强，其表达CXCR4上调，CXCR4的mRNA合成增强。与对照组相比，差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 AMI患者外周血来源EPCs的CXCR4受体表达上调，功能增强。
　　
　　
　　众多证据表明，循环中内皮祖细胞(endothelial progentior cells，EPCs)在成体血管形成中起了重要作用。动物和临床实验均表明，静脉注射EPcs，能显著促进缺血组织的血管新生及功能恢复，而同样条件下注射成熟内皮细胞却收效甚微。这些均表明了EPcs在机体生理或病理情况下对血管形成的重要作用。因而EPcs也成为研究的热点。正常人外周血循环中有一定数量的来源于骨髓的EPcs，参与维持血管壁的完整性。但冠心病人的EPCs数量减少，功能减低，且这种损害与冠心病的危险因素呈相关性。作为冠心病的一种特殊类型急性心肌梗死(acute myocardialinfarction，信捷职称论文写作发表网，AMI)，在急性期由于存在自体骨髓动员现象，EPCs却是升高的。但升高后的EPCs功能如何，少有报道。笔者研究了AMI急性期EPCs的CXCR4受体的变化，来试图解释其功能的变化，以期为提高EPCs治疗效果提供一种新的思路。
　　
　　1 资料与方法
　　
　　1．1 一般资料
　　
　　AMI患者15人，对照组为因非典型胸痛而行冠状动脉造影并排除冠心病的患者15人，2组临床资料。排除近期内有炎症、肿瘤、手术及合并糖尿病，服用雌激素、他汀类药物等影响EPCs因素的患者。
　　
　　1．2材料与试剂
　　
　　淋巴细胞分离液(相对密度1.077)购自上海生化试剂二厂；EGM-2-MV内皮细胞培养基购自Clonetic公司；胎牛血清(Fcs)购自GIBCO公司；人纤维连接蛋白购自Chemicon公司；FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)购自Sigma公司；基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、FITC标记的抗CXCR4抗体购自深圳晶美生物公司；改良的Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒、Taq DNA聚合酶和dNTP购自Fermcntas公司。引物由北京奥科公司合成。
　　
　　1．3 方法
　　
　　1．3．1 EPCs的分离、培养与鉴定 每例患者取外周血15 ml，分别常规密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板。加入EGM-2-MV培养基及5％FCS于5％CO培养箱中37℃恒温培养。培养4 d后，用PBS洗掉非贴壁细胞。为了维持细胞原先生存环境，换为EGM-2-MV培养基，加入20％的细胞来源患者血清，继续培养至7 d后进行各种检查分析。贴壁细胞用DiI-acLDL、FITC-UEA-I行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。每孔随机选择15个视野(×200)对EPCs计数。取其平均值换算成每平方毫米的细胞个数记录。
　　1．3．2 EPCs对SDF-l的迁移能力检测 用胰酶消化贴壁细胞并计数。将含SDF-1质量浓度浓度为100 ng/ml的培养液(EGM＋20％患者血清)30 μl注入改良的Boyden小室的下室，将含3×10个EPCs的培养液(同上)50μl注入上室，培养5 h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。
　　1．3．3流式细胞术分析 消化后的部分EPCs离心，沉淀重悬于PBS中，取约5×105细胞，加入FITC标记的抗CXCR4抗体及同型对照，于流式细胞仪(FACS Calibur，B－D公司)上进行阳性细胞记数，每次分析获取10个细胞。