1.2.7特异性淋巴细胞增殖实验将分离的脾淋巴细胞密度调整至5×108/L，在96孔板中用100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液培养，100 μL/孔，同时实验组每孔加入25 mg/L ESAT6CFP10纯化蛋白25 μL，而对照组不加此纯化蛋白，调零孔不加脾细胞，50 ml/L CO2孵箱培养68 h后每孔加20 μL MTT（5 g/L，溶于PBS，pH 7.2，过滤除菌），继续培养4 h后弃上清，加DEMSO 150 μL/孔，振荡培养10 min，测定A490 nm值. 结果用刺激指数＝实验组A490 nm/对照组A490 nm表示.

　　1.2.8IFNγ，IL2的诱生及含量测定将5×108/L脾细胞滴入96孔板后加入纯化ESAT6CFP10蛋白进行刺激，培养72 h后收集上清，-20℃冻存备检. 方法参照试剂盒说明（夹心ELISA法）测定各标本所含IFNγ，IL2浓度.

　　1.2.9CTL活性检测CTL检测采用乳酸脱氢酶（LDH）方法. 先确定靶细胞（稳定表达ESAT6CFP10融合蛋白的P815细胞系）最佳细胞数，将靶细胞按0， 5×106， 1×108， 2×108/L加入96孔板，检测不同细胞数量释放的LDH，最终确定5×106/L为最佳细胞数. 试验中同时设立靶细胞最大LDH释放量、靶细胞自发LDH释放量、效应细胞自发LDH释放量、细胞培养液LDH释放量和Volume Correction作为对照，试验组中靶细胞和效应细胞数量分别按1∶5，1∶10，1∶20，1∶50混匀加入. 免疫小鼠脾细胞分离后调整细胞浓度进行CTL检测，具体过程按试剂盒说明书进行.
 
　　1.2.10MTB H37Rv毒株的攻击实验最后一次免疫完成后2 wk，用MTB毒株H37Rv经尾静脉感染小鼠，剂量为0.2 mL/只（1×105 CFU），4 wk后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，接种罗氏培养基培养4 wk，计数细菌CFU.

　　统计学处理：  实验数据以x±s表示，统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验，P＜0.05为有统计学意义.
 
　　2结果

　　2.1免疫小鼠血清特异性抗体滴度DNA疫苗免疫BALB/c小鼠3次后，其血清中的特异性抗体滴度平均为1∶800. BCG免疫组中只存在抗MTB CFP抗体，不存在抗ESAT6CFP10融合蛋白抗体；同时生理盐水阴性对照组的小鼠血清抗ESAT6CFP10蛋白抗体全部为阴性.

　　2.2免疫小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖DNA疫苗能诱导免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖，其刺激指数为2.42±0.13，但其诱导淋巴细胞增殖明显不及BCG (3.43±0.13)，而生理盐水对照组淋巴细胞的增殖不显著，刺激指数为0.90±0.16.

　　2.3脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平免疫小鼠脾淋巴细胞悬液在体外用刺激后，IFNγ含量显著增加，DNA疫苗免疫组为（2449±12）ng/L，显著高于生理盐水阴性对照组（429±16）ng/L，与BCG免疫组（2530±15）ng/L无明显差别.

　　2.4脾脏淋巴细胞中诱生的IL2水平DNA疫苗诱导免疫小鼠IL2表达量增加，含量为（198±16）ng/L ；而生理盐水对照组只有（54±16）ng/L，均低于BCG免疫组（298±17）ng/L.

　　2.5特异性CTL杀伤效应DNA疫苗诱导的杀伤活性为42％（图1），比生理盐水组和BCG组高，但不及H37Rv组（62％）.

　　图1免疫小鼠脾细胞的细胞毒性活性检测　略

　　2.6免疫小鼠对MTB毒株攻击的抵抗作用MTB H37Rv毒株感染免疫小鼠4 wk后，DNA疫苗免疫组脾脏荷菌数(4.51±0.23)对MTB有一定抵抗力，但不及BCG免疫对照组（4.11±0.25， P<0.05），高于生理盐水对照组(6.51±0.13).
 
　　3讨论
　　
　　在抗MTB感染过程中，DNA疫苗已被证实能诱导持久保护性细胞免疫应答和体液免疫应答. DNA疫苗则可引起强烈的CD8+T细胞反应，诱导产生大量的抗原特异性CD8+/CD4-/CD44high T细胞，分泌IFNγ，引起有效的细胞免疫［5］ MTB的分泌蛋白MPT64, Ag85B和ESAT6是DNA疫苗良好的候选抗原，研究发现这些DNA疫苗有较高的保护作用，将三种重组质粒联合免疫动物所诱导的保护作用比单独使用一种质粒结果要好［6］，提示DNA疫苗未来研制策略有可能向融合型基因疫苗发展. 融合型DNA疫苗可以是抗原抗原融合，也可是抗原细胞因子的融合. ESAT6和CFP10是效应性T细胞的主要靶抗原，可诱导T细胞迅速增殖和释放高水平的IFNγ，有效地激活巨噬细胞，控制MTB感染. 研究表明单独编码ESAT6的基因疫苗的保护作用比MPT64强，信捷职称论文写作发表网，但这两种DNA疫苗的保护作用并未达到BCG的免疫效果［7］，所以需要加入其他免疫刺激源，如细胞因子或其他保护性抗原，才能取得良好效果. 基于此我们将MTB中两个保护性蛋白融合后构建成具有保护作用的基因疫苗，试图增强基因疫苗的保护效果.
　　
　　ESAT6和CFP10基因仅存在于少数致病性分枝杆菌中，而不存在于BCG及其他非致病分枝杆菌［8］，因此在BCG免疫小鼠血清未检测到ESAT6和CFP10的抗体. 另外在检测CTL活性时，由于BCG缺失这两个基因，BCG免疫小鼠脾细胞不会产生针对这两种抗原的特异性免疫应答，如以BCG作为融合蛋白诱导CTL活性的阳性对照就不能正确反应重组疫苗的免疫应答水平，因此我们在检测CTL活性时除设立正常BCG免疫组外，又设立了MTB H37Rv毒株免疫组作为阳性对照，以正确评价重组疫苗的CTL活性. DNA疫苗一般要接种3次，BCG临床接种程序为1次，故在保护力实验中，BCG组毒株攻击时间是在初免后6 wk进行，而DNA疫苗组是在末次免疫完后2 wk进行.
　　
　　Th1型免疫应答诱发产生的IFNγ是控制MTB在体内生长繁殖的重要因素，它可激活单核细胞和巨噬细胞，使其发挥杀菌作用. IFNγ由活化的Th1细胞产生，能增强巨噬细胞的抗分枝杆菌活性，其机制可能与增加过氧化氢和NO产生有关. 我们的研究发现ESAT6CFP10融合蛋白基因疫苗能诱导较强的细胞免疫应答，诱导的IFNγ与BCG相比也无明显差距，表明表达ESAT6CFP10融合蛋白的DNA疫苗免疫效果较好，可在TB防治中发挥重要作用.

　　【参考文献】

　　［1］Chan J, Kaufmann S. Immune mechanisms of protection in tuberculosis pathogenesis, protection and control［A］.  Bloom, BR. Ed. American Society of Microbiology［M］. Washington: Kluwer Academic Publishers.  1994:9389-9415.

　　［2］ Berthet F, Rasmussen P, Rosenkrands I, et al. A mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT6 and a novel lowmoleclarmass culture filtrate protein(CFP10) ［J］. Microbiology,1998, 144 (11):3195-3203.

　　［3］ 张海，师长宏，薛莹，等.  结核分枝杆菌esat6cfp10融合基因疫苗构建及表达［J］. 第四军医大学学报，2005，26（3）：193-195.

　　［4］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual［M］. New York:  cold spring harbor laboratory press:1999: 1613-1619

　　［5］ Lowrie DB, Silva CL.  Enhancement of immunocompetence in tuberculosis by DNA vaccination［J］. Vaccine, 2000, 18(16): 1712-1716.

　　［6］ Kamath AT, Feng CG, Macdonald M, et al. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of mycobacterium tuberculosis［J］. Infect Immun, 1999, 67(4):1702-1707.

　　［7］ 潘怡，蔡宏，李淑霞，等.  结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果［J］. 生物化学与生物物理学报，2003,35（1）:71-76.

　　［8］ 乐军，王洪海，胡宏.  结核杆菌的后基因组研究进展［J］. 国外医学临床生物化学与检验学分册，2003,24（2）:72-73.