【关键词】  生存素基因；细胞周期素B1基因；急性白血病；逆转录聚合酶链反应

     
　　Expressions of survivin and cyclin B1 gene in childhood acute leukemia

    【Abstract】 AIM: To investigate the expressions and significance of survivin and cyclin B1 gene in childhood acute leukemia (AL). METHODS: The expressions of survivin and cyclin B1 gene were examined by RTPCR in bone marrow cells from 42 children with incipient or relapsed AL， 13 with completely remissive AL (ALCR) and 15 without malignant disease as a control group. RESULTS: In incipient and relapsed AL groups, the expression level of survivin were 0.472 and 0.810, cyclin B1 were 0.606 and 0.739, which were remarkably higher than those in control group and ALCR group (P<0.01). There was a significantly difference between incipient AL group and relapsed AL group in the expression level of survivin mRNA (P=0.025). The expression of survivin gene was associated with initial white blood cell (WBC) count and clinical types of AL. The expression of cyclin B1 gene was not correlated with age, sex, immunogenic type, initial WBC count and clinical types of AL. There was a significantly positive correlation between the expression of survivin gene and cyclin B1 in Childhood AL (r=0.6864, P<0.01). Patients with high survivin expression level achieved a lower rate of complete remission (CR) than those with low expression level of survivin. CONCLUSION： Survivin and cyclin B1 gene are expressed widely in specimens of AL, and there is a positive correlation between them. Overexpression of survivin may imply the lower sensitivity of the leukemic cells to chemotherapy and the higher risk of relapse. Overexpression of survivin might be an index of treatment effect, and might be related to poor prognosis.

    【Keywords】 survivin;  cyclin B1;  acute leukemia;  reverse transcriptionpolymerase chain reaction

    【摘要】 目的： 探讨基因生存素，细胞周期素B1的表达与儿童急性白血病（AL）的关系. 方法：采用RTPCR对初治或复发AL患儿42例和完全缓解AL(ALCR)患儿13例及非恶性疾病患儿15例骨髓单个核细胞进行基因生存素，细胞周期素B1表达的检测. 结果：初治和复发AL组生存素 mRNA表达水平分别为0.472和0.810，细胞周期素B1 mRNA为0.609和0.739，均高于ALCR组（0）和对照组（0）（P<0.01）；复发AL组生存素 mRNA表达水平高于初治组，有统计学差异（P=0.025）. 生存素基因的表达与白细胞总数及临床分型有关，与性别、年龄、免疫分型无明显相关性. 细胞周期素B1表达与性别、年龄、免疫分型、白细胞总数及临床分型无明显相关关系. 儿童AL中生存素与细胞周期素B1的表达呈正相关. 生存素 mRNA表达水平高者缓解率低. 结论：儿童AL中存在生存素，细胞周期素B1异常表达，两者表达存在相关性. 生存素是AL复发的高危因素；AL 生存素高表达者可以降低AL的化疗敏感性，生存素水平对AL有判断疗效和预后的价值.

    【关键词】 生存素基因；细胞周期素B1基因；急性白血病；逆转录聚合酶链反应

      凋亡相关基因与白血病的治疗及耐药有关. 生存素是一种凋亡抑制蛋白，与肿瘤发生有密切关系［1］. 细胞周期素B1是细胞周期调节因子，它的异常表达将导致细胞周期发生紊乱，致使肿瘤形成. 我们采用逆转录多聚酶链式反应(RTPCR)的方法对初治、复发、化疗后达完全缓解的急性白血病(acute leukemia, AL)患儿以及对照组骨髓单个核细胞生存素基因的表达进行了检测，以探讨生存素和细胞周期素B1基因与儿童急性白血病的关系及其临床意义.

    1对象和方法

    1.1对象200402/200411 AL患儿55（男36，女19）例，年龄2～14岁. 其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 43例(L1 4例，L2 36例，L3 3例)，急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphocytic leukemia, ANLL) 12例(M2a 6例，M2b 1例，M3a 3例，M3b 1例，M4b 1例). 初治35例，完全缓解(ALCR) 13例，复发7例. 初治组中ALL 26例，其中BALL 16例，TALL 5例，5例未进行免疫分型，ANLL 9例. 各组性别、年龄等条件相似. 对照组15（男9，女6）例，年龄3～14岁. 为同期住院非恶性血液病（特发性血小板减少性紫癜、缺铁性贫血等）患儿.

    1.2方法Trizol试剂（Gibco公司）；逆转录酶MMLV(Promega公司)，Taq酶（Sangon公司）；PCR扩增仪（MJ公司220型）. 抽取患者骨髓液1～2 mL，ACD抗凝，采用Ficoll密度梯度离心分离出单个核细胞(mononucleic cell, MNC)，采用Trizol试剂抽提并制备总RNA. cDNA的合成包括总RNA 2 μL (1 g/L), oligo(dT)18 1.0 μL，加ddH20至12 μL，70℃反应5 min，冰上冷却，加入5×Buffer 4.0 μL，RNasin核糖核酸酶抑制物1.0 μL，10 mmol/L的dNTPs 2.0 μL，37℃反应5 min，加MMuLV逆转录酶(200 MU/L) 1.0 μL，终体积20 μL，42℃反应60 min，信捷职称论文写作发表网，70℃反应10 min后冰上冷却完成反应. PCR扩增  生存素上游引物：5′ACCGCATCTCTACATTCAAG3′，生存素下游引物：5′CTTTCTTCGCAGTTTCCTC3′；细胞周期素B1上游引物： 5′CCATTATTGATCGGTTCATGCAGA3′，细胞周期素B1下游引物： 5′CTAGTGCAGAATTCAGCTGTGGTA3′；βactin上游引物：5′AAGAGAGGCATCCTCACCCT3′，βactin下游引物：5′TACATGGCTGGGGTGTTGAA3′. 生存素扩增产物长度342 bp，细胞周期素B1扩增产物长度585 bp，βactin扩增产物长度218 bp. PCR反应体系为25 μL，包括逆转录产物cDNA 2 μL，10×PCR反应缓冲液2.50 μL，10 mmol dNTP 0.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，生存素（或细胞周期素B1）上、下游引物,βactin上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），Taq DNA聚合酶(83.35 mkat/L) 0.2 μL，其余用水补足. 生存素反应条件为：94℃ 30 s，54℃ 30 s，74℃ 40 s，30个循环. 细胞周期素B1反应条件为：94℃ 60 s，54.7℃ 60 s，74℃ 40 s，32个循环. 取扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，有目的基因扩增片断特异性条带者的为阳性，以无模板的PCR产物为阴性对照. 利用Gel Doc 2000系统对凝胶图像进行分析，计算样本生存素，细胞周期素B1基因PCR产物条带光密度与βactin PCR产物条带光密度比值，即为生存素，细胞周期素B1基因表达水平.

    统计学处理：使用SPSS 10.0软件包处理. 生存素，细胞周期素B1基因的表达数据用中位数(P25～P75)表示，组间比较进行秩和检验，对列联表资料进行相关分析，检验水准α=0.05.

    2结果

    2.1生存素，细胞周期素B1 mRNA的表达初治和复发组表达均高于对照组；缓解组和对照组表达无差异；复发组生存素表达高于初治组（图1,2），复发组细胞周期素B1表达和初治组间无差异（表1）. ANLL患者生存素 mRNA表达中位数为0.536，ALL为0.450，两者比较无显著性差异（P=0.853）. ANLL 细胞周期素B1 mRNA表达中位数为0.606，ALL为0.592，两者的表达水平无统计学差异（P=0.590）.表1儿童白血病生存素，细胞周期素B1 mRNA的表达比较

    2.2生存素，细胞周期素B1 mRNA表达与临床特征初治AL组中生存素mRNA在WBC≥50×109/Ｌ患者表达水平为0.748，在WBC<50×109/Ｌ患者为0.442，两者差异有显著意义（P=0.019）. 高危型患者生存素 mRNA表达水平为0.699，低危型