L┐NAME对新生鼠缺氧性脑损伤内源性NO和ET的影响
作者:佚名; 更新时间:2014-12-13

         作者:王玲,惠延平,侯英萍 ,鱼绥和

关键词】  L-硝基-精氨酸甲酯

  关键词: L-硝基-精氨酸甲酯;内皮素;一氧化氮;脑缺氧;新生鼠
    
  摘 要:目的  用新生大鼠急性缺氧模型,探讨NO合成酶抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)在缺氧后脑损伤中的作用,进而探讨一氧化氮(NO)和内皮素(ET)在早期缺氧性脑损伤中的作用地位. 方法  检测正常对照组、缺氧组和缺氧前应用L-NAME预处理的新生大鼠血浆ET及脑组织匀浆NO含量及NOS的活性,并观察各组大鼠脑组织病理改变及毛细血管充盈不良程度. 结果  缺氧组血浆ET水平较正常对照组显著升高(P<0.01),而脑NO水平及NOS活性无显著变化(P>0.05),脑毛细血管充盈不良程度与正常对照组相比明显加重(P<0.05);L-NAME组血浆ET水平较缺氧组显著升高(P<0.05),脑NO含量及NOS活性较缺氧组显著下降(P<0.01),脑毛细血管充盈不良程度与缺氧组相比明显加重(P<0.05). 结论  急性缺氧早期,ET异常增高是脑损伤的主要因素;此时抑制内源性NO的合成,可加重脑组织的微循环障碍而导致脑缺氧缺血性损害的进一步加重. Effect of L┐NAME on NO and
  ET in newborn rats with hypoxic brain injuries
       
  Abstract:AIM To explore the role of nitric oxide(NO)and endothelin(ET)in the early phase of hypoxic brain injuries by examing the effect of Nω -nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME),an inhibitor of nitric oxide synthase(NOS),on brain NO production and serum ET level in newborn rats with hypoxic brain injuries.METHODS The rats were di-vided into normal control group,hypoxia group and L-NAME+hypoxia group.The ET level in serum,NO pro-duction,NOS activity,pathology and capillary perfusion in brain were investigated in3groups.RESULTS The serum ET level of hypoxia group was significantly higher than that of controls(P<0.01),but NO production and NOS activity were not significantly different between2groups(P>0.05),and the brain capillary perfusion was more serious in hypoxia group that that in controls.Compared with the hypoxia group,the serum ET level of L-NAME+hypoxia group was increased significantly(P<0.05),NO production and NOS activity in brain was decreased significantly(P<0.01),and brain capillary perfusion was serious significantly(P<0.05).CONCLUSION Abnormal increase of serum ET in early phase of acute hypoxia is the main factor of brain in-jury;NOS inhibitor L-NAME may make microcirculation dysfunction worse and lead to a further hypoxic-ischemic brain injury.
    
  0 引言
    
  一氧化氮(NO)和内皮素(ET)在围产期窒息时两者均升高,但它们在窒息后脑损伤中的作用及应用NO合成酶抑制剂的利弊尚存在争论.我们应用NO合成酶抑制剂L-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)对围产期窒息动物模型进行预处理,观察缺氧后内源性NO和ET的含量变化及其与脑组织病理和微循环变化的关系,从而探讨两者在早期缺氧性脑损伤中的作用地位及应用L-NAME的利弊.
    
  1 材料和方法
    
  1.1 材料 

  新生10d的SD大鼠(体质量18~24g),由本校实验动物中心提供;L-NAME由Sigma公司生产;ET试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所;NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所;NOS试剂盒购自郑州中亚生物工程公司.

  1.2 方法
    
  1.2.1 缺氧动物模型制备[1]   将正常分娩的新生10d的SD大鼠30只随机分为正常对照组、缺氧组及L-NAME组各10只.L-NAME组ip L-NAME3mg kg-1 ,另两组分别ip相同剂量的无菌生理盐水,1h时后将缺氧组及L-NAME组置于有机玻璃缺氧房内,按一定比例输入O2 和N2 ,监控仪控制氧浓度在7%,房内温度24℃,缺氧时间持续1h.4h后各组大鼠断颈取血1mL加入抗凝管,4℃3000r min-1 离心20min,取血浆置-20℃冰箱,用于检测血浆ET水平,然后断头处死动物,立即取出脑组织备用.
    
  1.2.2 血浆ET浓度检测 

  采用放射免疫分析法测定,用γ计数检测仪按药盒说明书测定放射活性.

  1.2.3 脑NOS活性及NO含量测定 

  将脑组织精确称质量,在冰浴中按质量比1 9加入4℃生理盐水,玻璃匀浆器在冰水中匀浆,然后4℃3000r min-1 离心10min,取上清液用分光光度法测NO含量和NOS活性.NOS活性定义为每分钟克组织蛋白产生1nmol NO为1000个活性单位(×10 3 U g-1  min-1 ).组织蛋白含量测定用双缩脲法.
    
  1.2.4 脑组织病理检查 

  大脑皮层组织标本用40g L-1 甲醛固定、石蜡包埋后,切片,常规HE染色,光镜下观察脑组织病理变化;在脑冠状切面上,对毛细血管充盈不良程度进行分级[2] :Ⅰ级偶见皮质辐射状毛细血管不充盈;Ⅱ级皮质或(和)皮质下小区域不充盈;Ⅲ级皮质与皮质下交界区不充盈;Ⅳ级皮质下和
    基底神经节广泛灌注不良.    

  统计学处理:所有数据用x ±s表示,各组数据间的差异,采用F检验;毛细血管充盈不良程度用每一级的例数表示,并用Ridit分析进行比较.
    
  2 结果
   
  2.1 大鼠血浆ET及脑NO含量和NOS活性的变化 

  缺氧组新生大鼠血浆ET水平较正常对照组显著升高(P<0.01),而脑NO含量及NOS活性较正常对照组无显著改变(P>0.05);L-NAME预处理组,血浆ET水平与缺氧组相比显著升高(P<0.05),脑NO含量及NOS活性较缺氧组显著降低(P<0.05~0.01,Tab1).表1 各组新生大鼠血浆ET及脑NO含量和NOS活性(略)

  2.2 脑组织病理改变 

  正常对照组大鼠脑组织光镜下显示细胞形态结构基本正常;缺氧组光镜下可见脑组织细胞肿胀及间质水肿,并有少许炎细胞浸润,大脑皮层散在点状出血灶;L-NAME组亦表现为脑组织细胞肿胀及间质水肿及大脑皮层散在点状出血灶.各组可见程度不等的毛细血管充盈不良(Fig1,2),各组大鼠脑毛细血管充盈不良程度(Tab2). 图1 脑皮质毛细血管充盈良好(Ⅰ级)表2 各组大鼠脑毛细血管充盈不良程度的比较(略)



  3 讨论
    
  研究证实,脑缺氧缺血急性期血浆、脑脊液和脑组织中ET水平明显升高[3] ,引起血管收缩使脑血流量明显下降,并直接损伤神经元及胶质细胞参与脑损伤的形成和发展,ET介导的钙内流是神经细胞死亡的最终途径.本组新生鼠窒息后血浆ET迅速明显升高,NO水平无明显变化,脑组织病理检查可见细胞肿胀及间质水肿和脑微循环障碍,说明窒息早期ET的异常增高是脑损伤的主要因素,与国内Xu等[4] 报道结果相似.NO在脑缺血缺氧性损伤发病中的作用也引起了广泛的重视.大量研究提示,脑缺氧缺血时NO的增高,主要由神经元型NOS(nNOS)和内皮型NOS(eNOS)介导,它通过NO/cGMP途径使脑血管扩张、增加脑血流,对神经细胞起保护作用[5] ;而缺氧缺血后期所产生的大量的诱导型NOS(iNOS)及NO的过度释放则起着细胞毒性作用,与脑水肿、脑损伤的发生密切相关[6] .本组新生鼠缺氧早期NO虽轻度升高,但与正常对照组无明显差异.近年研究发现,ET的缩血管作用较NO的扩血管作用强,而且ET和NO之间有着相互制约的关系.ET和NO之间的动态平衡在缺氧时被打破,两者之间相互作用关系可能是ET增高使细胞内Ca2+ 超载,血管收缩、细胞水肿,同时Ca 2+ 与钙调节蛋白结合,激活NOS,合成NO,而NO增加可以激活鸟苷酸环化酶使细胞内cGMP升高[7,8] .现已发现内皮细胞内cGMP升高可抑制内皮素的分泌,提示NO可间接地抑制内皮素的分泌[7] .本实验结果发现,给予NO合成酶抑制

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