【关键词】  ,肿瘤

    Apoptosis of tumor cells induced by mutant and wild type TNFα

　　【Abstract】   AIM: To compare the apoptosisinduced ability of recombinant human mutant type 471 rhTNFα (mt 471rhTNFα) with that of wild type rhTNFα (wt rhTNFα) and to study the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. METHODS:  The apoptosis of ZR751 cells, a breast cancer cell line, induced by mt 471rhTNFα or wt  rhTNFα was analyzed and compared by 20 g/L agarose gel electrophoresis and flow cytometry techniques. The activation profiles of nuclear factor NFκB   in ZR751 cells untreated and treated by mt 471rhTNFα or wt  rhTNFα were detected using Trans AMTM NFκB p65 kit based on ELISA for further study of the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. RESULTS:  The results from 20 g/L agarose gel electrophoresis of genomic DNA indicated that ZR751 cells treated by mt 471rhTNFα provided a typical apoptotic ladder pattern of DNA fragmentation, whereas weakened ladders were observed in ZR751 cells treated by wt rhTNFα. Flow cytometry showed that the cell apoptotic rate  in mt 471rhTNFα treated group was 43%, but 25% in wt rhTNFα treated group. The mt 471rhTNFα held a strong apoptosisinducible ability. The results of DNAbinding activity of NFκB showed that NFκB activation induced by wt rhTNFα was significantly higher than that of mt 471rhTNFα when the protein concentration of mt 471rhTNFα or wt rhTNFα reached 50 μg/L (P=0.002). CONCLUSION:  The apoptosisinduced ability of mt 471rhTNFα is superior to that of wt rhTNFα. One of the possible reasons for the enhanced apoptosisinduced ability may be that NFκB activation is inhibited in tumor cells treated with mt 471rhTNFα.

　　【Keywords】 neoplasms; mutant type 471rhTNFα; wild type rhTNFα;  NFkappaB; apoptosis

　　【摘要】  目的： 比较重组人突变型471rhTNFα（mt 471rhTNFα）与野生型rhTNFα（wt rhTNFα）诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力，并对mt 471rhTNFα诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究. 方法： 以乳腺癌细胞系ZR751细胞为靶细胞，应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt 471rhTNFα与wt rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的情况；利用以ELISA为基础的Trans AMTM NFκB p65试剂盒检测经mt 471rhTNFα或wt rhTNFα处理的ZR751细胞核因子NFκB的活化情况，以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究. 结果： 20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，mt 471rhTNFα处理组的ZR751细胞基因组DNA呈现明显的ladder状分布，wt rhTNFα处理组的“ladder”条带明显减弱；流式细胞仪分析显示，mt 471rhTNFα诱导的细胞凋亡峰面积高于wt rhTNFα处理组. NFκB活化检测结果显示，当两型rhTNFα浓度增高到50 μg/L时，wt rhTNFα处理组的NFκB的活化量明显高于同浓度的mt 471rhTNFα处理组（P=0.002）.  结论： mt 471rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wt rhTNFα；肿瘤细胞内NFκB活化明显受抑是mt 471rhTNFα诱导凋亡能力增强的主要原因之一.

　　【关键词】 肿瘤；突变型471rhTNFα；野生型rhTNFα； NFκB；细胞凋亡

　　0引言

　　人肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα），主要由巨噬细胞产生，是具有多种生物学活性的细胞因子. mt 471rhTNFα是删除wt TNFαN端的7个氨基酸，并将Pro8Ser9Asp10置换为Arg8Lys9Arg10［1］的突变体.  这种突变并不改变TNFα分子的高级结构，仍然形成具有生物活性状态的三聚体，抗肿瘤作用增强且毒副作用降低，极具开发价值. 我们在获得mt 471rhTNFα重组蛋白的基础上［2-4］，进行新的研究，为mt 471rhTNFα的临床前研究提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　两种基因工程蛋白在大肠杆菌DH5α中进行表达，初步检测具有良好的生物学活性. 乳腺癌细胞系（ZR751）为本室保存. 细胞培养基RPMI1640系GIBCO BRL产品，FCS购自杭州四季青生物技术公司. Trans AMTM NFκB p65 Kit由晶美生物工程有限公司提供. 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒由碧云天生物技术研究所提供.

　　1.2方法

　　1.2.1确定mt 471rhTNFα与wt rhTNFα浓度蛋白溶解液溶解冷冻干燥蛋白，按1∶100稀释，测定280 nm和260 nm下的A值，确定蛋白的浓度；另取10 μL加等体积2×蛋白电泳载样液，行150 g/L  SDSPAGE凝胶电泳，BackMan光密度扫描仪进行薄层扫描，以确定目的蛋白的含量.
 
　　1.2.2两型rhTNFα诱导细胞凋亡复苏ZR751细胞，传代培养至对数生长期，胰蛋白酶消化，Hank's液终止消化，收集细胞，并调整细胞数至2×108/L. 将细胞分为3组，即ZR751对照组、wt rhTNFα和mt 471rhTNFα处理组. 培养基中放线菌素D的终浓度为0.5 μg/L，样品终浓度为0.1 mg/L，信捷职称论文写作发表网，于加药后12 h收集细胞. 将细胞分为两部分，一部分用于20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，另一部分用于流式细胞分析，以PBS洗涤细胞，RNase降解RNA, 700 mL/L乙醇固定，待用. 检测时，PBS洗涤以弃除700 mL/L乙醇，空干，碘化丙啶（PI）避光染色15 min以上. PBS洗涤后，将细胞重新悬于1 mL PBS中，用EPICS ELITE, COULTER, USA型流式细胞仪分析比较两型TNFα诱导细胞凋亡的情况.

　　1.2.3核蛋白的提取并定量按1.2.2的处理方法复苏并传代ZR751细胞，但样品终浓度分别为10 μg/L和50 μg/L，作用4 h后收集细胞，分别提取各实验组的细胞核蛋白质，操作按试剂盒说明书进行，即： 用PBS洗涤细胞，20 μL细胞沉淀加入200 μL细胞浆蛋白抽提试剂，振荡5 s将细胞沉淀充分悬浮，加细胞浆蛋白抽提试剂B 10 μL. 高速振荡5 s，冰浴1 min. 4 ℃, 12～16 kg,离心5 min，吸取上清至预冷的塑料管中，即为细胞浆蛋白.在沉淀中加入50μL细胞核蛋白抽提试剂，剧烈振荡15~30 s，把沉淀完全悬浮. 冰浴，每隔1~2 min再高速剧烈振荡15~30 s，共30 min. 4℃, 12～16 kg,离心10 min，吸取上清至预冷的塑料管中，即为细胞核蛋白，紫外分光光度计下进行蛋白定量，-70℃冻存.

　　1.2.4基于ELISA法的NFκB活性检测操作按照Trans AMTM NFκB p65试剂盒说明书进行，简介如下： 加入3 μg的细胞核蛋白抽提物，室温孵育1 h，期间温和摇动96孔板，使之均匀地结合；用200 μL的洗涤buffer洗涤3次，加入100 μL 以1∶1000稀释的NFκB抗体，勿摇动，室温下孵育1 h；用200 μL 的洗涤buffer洗涤3次，加入100 μL 以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶聚合的二抗，室温下孵育1 h；用200 μL 的洗涤buffer洗涤4次，室温下每孔中加入100 μL的展呈液，及时观察颜色的变化，直到培养基的颜色变为深蓝色时加入100 μL 的终止液，遇酸时，蓝色变为黄色，测定450 nm下的A值. 利用试剂盒中提供的突变寡核苷酸进行NFκB特异性结合为对照.

　　统计学处理： 以SPSS 11.0软件进行统计学分析，两实验组NFκB的活性检测分析采用t检验，P<0.05认为有统计学差异.

　　2结果

　　2.1mt 471rhTNFα与野生型rhTNFα的浓度由两样品的SDSPAGE结果及BackMan光密度扫描仪薄层扫描结果可知，目的蛋白的纯度为96.7%和93.1%；紫外分光光度法测定A280 nm和A260 nm吸光度值，可知wt rhTNFα蛋白的产量为3.48 g/L, mt 471