2.2诱导ZR751细胞凋亡的检测ZR751细胞在含有放线菌素D的培养液中，在mt 471rhTNFα与wt rhTNFα处理组中，分别加入10 μg/L的mt 471rhTNFα与wt rhTNFα，分别经两样本作用12 h后，进行细胞基因组DNA 20 g/L琼脂糖凝胶电泳. mt 471rhTNFα组的细胞基因组DNA降解成不同倍数的180~200 bp大小的片段，呈现明显的ladder状分布（Fig 1）.
2.3流式细胞仪检测ZR751细胞凋亡与对照组相比，虽然两实验组均有凋亡峰出现，但mt 471rhTNFα诱导的凋亡峰面积占43%，wt rhTNFα诱导凋亡峰面积占25%, mt 471rhTNFα诱导的凋亡峰面积高于同浓度wt rhTNFα诱导组，对照组未见凋亡峰.
2.4不同实验组ZR751中的NFκB活性实验中，我们选择了不同的TNFα浓度处理ZR751细胞，实验结果可知(n=3)当两型rhTNFα以浓度为10 μg/L作用于ZR751细胞4 h后，与对照组A均值0.6±0.03相比，wt rhTNFα和mt 471rhTNFα处理组的NFκB活化均有增加，其A均值分别为1.35±0.1732和0.9±0.1, wt rhTNFα处理组的NFκB活化增加量高于mt 471rhTNFα处理组（t=7.68, P=0.002）；当两型TNFα浓度增高到50 μg/L时，wt rhTNFα处理组的增加量明显增多其A均值为(3.48±0.13)，而mt 471rhTNFα处理组仅有轻度升高，A均值为(1.65±0.217)，两实验组间有显著差异（t=12.49, P=0.000）；当样品的浓度为100 μg/L时，特别是mt 471rhTNFα处理组的细胞有明显的死亡，未见到明显的NFκB活性改变；此外，两个实验组均未见到NFκB活化量随TNFα作用时间的延长而增加， 在一定浓度范围的TNFα作用下，细胞NFκB的活化有剂量依赖性.
3讨论
我们在获得高纯度和高活性mt 471rhTNFα的基础上，对两型TNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力及相关机制进行了初步比较研究. 研究发现，mt 471rhTNFα杀伤肿瘤细胞的作用是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡实现的，与wt rhTNFα相比，mt 471rhTNFα诱导ZR751细胞发生凋亡的作用明显增强. 分析mt 471rhTNFα诱导凋亡能力增强的主要因素可能与以下因素有关：首先，TNFα作用于不同亚型的受体（TNFR1和TNFR2）可以激活不同的信号传导途径. 已有的研究报道mt 471rhTNFα由于在N端进行了缺失突变和氨基酸置换，与TNFR1的亲和力显著提高，对TNFR2的亲和力降低［1］. 存在于大部分细胞表面的TNFR1是一个含有死亡域（death domain）的受体，接头蛋白TNFRⅠ相关死亡域蛋白（TRADD）与TNFR1分子的胞内死亡域部分相结合，而TRADD随后又引起的另一个接头蛋白Fas相关死亡域蛋白（FADD）的招募，因此形成了诱导凋亡的信号传导复合物，此复合物通过caspase8的活化启动了凋亡. 其次，主要表达在髓性细胞和受刺激的T或B淋巴细胞表面的TNFR2，可以激活NFκB，具有抗凋亡的作用并引起全身毒副作用［5,6］. 为了进一步分析本实验中肿瘤细胞的凋亡是否与NFκB的活化有关，我们采用TRANSAM NFκB转录因子测定试剂盒，此法较凝胶分析更为灵敏，它是以ELISA为基础，将NFκB的p65亚单位结合位点的共有序列，即5′GGGACTTTCC3′包被于96孔板上，细胞核蛋白中转录因子NFκB的活化形式能够与此寡核苷酸特异性结合，而识别转录因子的一抗则与转录因子结合，再用抗IgG偶联物和显色反应，容易得到定量的结果. 实验中，wt rhTNFα处理组的NFκB的活化量显著高于mt 471rhTNFα处理组，此结果证实了mt 471rhTNFα与TNFR2的结合力降低，使NFkB的活化受到抑制这一设想. wt rhTNFα在与TNFR1或TNFR2结合时并没有明显的选择性，它与受体结合后不仅介导凋亡信号的发生，同时也具有部分活化NFkB的作用，因此，wt rhTNFα只可以引起轻微的凋亡；而mt 471rhTNFα与TNFR2的亲和力降低，造成NFκB的活化量明显减少，引起大量的靶细胞发生凋亡，因此mt 471rhTNFα可能具有更强的抗肿瘤作用. 研究认为，NFκB是一种广泛分布的多效性的核因子［7,8］，它可以调节一些编码细胞因子、细胞黏附分子和生长因子的基因表达［9］，为大部分肿瘤细胞提供有重要意义的生存蛋白，如IAP家族、survivin蛋白等；激活凋亡抑制基因的转录，如cmyc，CD40L等，抑制了肿瘤细胞的凋亡而促进其生存. 目前，NFκB已经成为人们密切关注的抗癌药物治疗的靶点. 我们推测mt 471rhTNFα是通过下调NFκB的抑凋亡能力，而拥有了相对较强的抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力. 值得注意的是细胞凋亡并不只是线性通路，而更可能存在凋亡信号分子相互影响的环性通路. 尤其是半胱天冬氨酸酶、线粒体膜Bcl2 家族以及细胞色素C 间存在的相互作用，使得上游分子和下游分子的凋亡信号可以呈环形级联放大，也可以由一些抑制凋亡的分子如 Bcl2 等阻断这种环形放大的级联效应，从而有效地抑制凋亡［10］. 因此，究竟mt 471rhTNFα是否存在其它诱导肿瘤凋亡的机制，有待于我们进一步的研究.
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