【关键词】  哮喘

　　Expression of epidermal growth factor receptor and its ligands in chronic asthma mice and the influence of dexamethasone

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of epidermal growth factor receptor (EGFR) system on the asthmatic airway remodeling.METHODS:  The chronic asthma mice model was established by ovalbumin (OVA) immunization. Mice were injected intraperitoneally with dexamethasone of 2 mg/kg 1 h before the sensitization and sacrificed by cervical dislocation 24 h after the last challenge. Conventional pathological slides were also observed to study the pulmonary inflammation and the thickness of airway wall and airway smooth muscles. The concentration of TGFα in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was detected by ELISA. RTPCR was conducted to detect the mRNA expression of EGFR in the lungs. Pulmonary EGFR protein was observed by immunohistochemical staining and Western blot analysis. RESULTS:  In chronic asthma mice, inflammatory cell infiltration around bronchi and vessels could been seen on slides. The airway wall and the airway smooth muscles thickened and TGFα in BALF increased. The expression of EGFR mRNA and protein in the lungs increased (P<0.01). Dexamethasone injection before sensitization decreased TGFα in BALF and the expression of phosphoEGF receptor protein in the lung alleviated the pulmonary inflammation and inhibited the thickening of airway wall and airway smooth muscle (P<0.01). CONCLUSION:  Airway remodeling occurs in the chronic mice asthma model. Early dexamethasone injection can inhibit the expression and activation of EGFR system, decrease the TGFα concentration in BALF and prevent the airway remodeling.

　　【Keywords】 asthma;  airway remodeling;  receptor, epidermal growth factor; transforming growth factor alpha; dexamethasone

　　【摘要】  目的： 探讨表皮生长因子受体（EGFR）在慢性哮喘气道重建中的作用. 方法： 建立小鼠慢性哮喘模型，致敏前1 h气道内滴入地塞米松2 mg/kg，最后一次激发24 h后处死动物，常规病理切片观察小鼠肺内炎症情况、气管壁厚度及气道平滑肌厚度，ELISA法测定肺泡灌洗液中TGFα的浓度，RTPCR观察小鼠肺部EGFR mRNA的表达，免疫组化及Western Blot观察EGFR蛋白的表达. 结果： 慢性哮喘组小鼠气道支气管及血管周围大量炎症细胞聚集、气管壁及气道平滑肌增厚、肺泡灌洗液中TGFα浓度增高，肺组织EGFR mRNA及EGFR蛋白的表达增高(P<0.01). 哮喘小鼠致敏前使用地塞米松可减轻气道炎症，减少气管壁及气道平滑肌的增厚，肺泡灌洗液中TGFα浓度、肺组织磷酸化EGFR蛋白的表达较慢性哮喘组均有所下降(P<0.01). 结论： 慢性哮喘小鼠出现气道重建，早期使用地塞米松可以预防气道重建，降低BALF中TGFα的浓度、抑制肺组织EGFR的表达和活化.

　　【关键词】 哮喘；气道重建；受体，表皮生长因子；转化生长因子α；地塞米松

　　0引言

　　气道重建是哮喘的特征性病理改变，成为顽固性哮喘的病理基础，直接影响治疗效果，是目前哮喘研究的热点问题之一. 我们建立了小鼠慢性哮喘模型，观察了慢性哮喘小鼠气道重建情况、表皮生长因子受体（epidermal gronth factor receptor, EGFR）和其配体表达的变化及地塞米松对其的影响，旨在探究EGFR系统在慢性哮喘气道重建中的作用.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　6周龄雌性BALB/C小鼠40只，体质量20~25 g，信捷职称论文写作发表网，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；UV1000紫外分光光度计（英国Cambridge公司）；DYA型电泳仪（上海生化所申华生化技术开发公司）；PCR扩增仪（GeneAmpPCRsystem 9600 PERKIN  ELIMER）； FLUORSTM Multimager多功能图像分析仪（BioRAD）；Leica Q500 MC图像分析系统（德国）；卵白蛋白干粉（GradeⅤ）（美国Sigma公司）；氢氧化铝（上海生物制品有限公司）；地塞米松磷酸钠注射液（天津市氨基酸公司人民制药厂）；小鼠TGFα ELISA试剂盒（上海生物晶美公司）；Trizol（Gibcol BRL公司）；One Step RNA PCR Kit （TaKaRa公司）；EGFR mAb（Cell Signaling Technology）；磷酸化EGFR mAb（Cell Signaling Technology）.

　　1．2方法

　　1．2．1动物模型及分组健康BALB/C小鼠40只，随机等分为4组，每组10只，A组为正常对照组，B组为慢性哮喘组，C组为地塞米松处理组，D组为生理盐水处理组. 置于相对清洁恒温环境. 予以标准饲料，自由取水. 参照文献［1］制备动物模型，将OVA 20 μg加2.6 mg氢氧化铝溶于pH为7.4的PBS 0.2 mL中，于第0, 7, 14日给B组、C组、D组小鼠腹腔注射，A组小鼠腹腔注射0.2 mL PBS；于第20~29, 47, 61, 73~75日鼻腔内滴入OVA抗原液50 μL（含OVA 100 μg），A组小鼠鼻腔内滴入PBS 50 μL；C组小鼠每次滴入OVA前1 h腹腔注射地塞米松0.2  mL（50 μg），D组小鼠每次滴入OVA前1 h腹腔注射PBS 0.2 mL. 小鼠出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌痉挛为阳性反应. 最后一次激发24 h后颈椎脱臼处死动物.
 
　　1．2．2BALF中TGFα的检测按照ELISA检测试剂盒操作流程检测各组小鼠BALF中TGFα含量.
 
　　1．2．3肺组织EGFR mRNA的测定根据One Step RNA PCR Kit试剂盒说明书，用半定量RTPCR法测定各组小鼠肺组织EGFR mRNA. EGFR引物序列(扩增片段长499 bp)： 上游引物5′AGAAGATGGCATCCGCAAGT3′；下游引物5′ATTGGG TGTCCCGAAGAGTT3′. GAPDH引物序列(扩增片段长306 bp)： 上游引物5′ cctgcatccactggtgctgc3′；下游引物5′ CTTGACAAAGTTGTCATTGA3′.
 
　　1．2．4Western blot印迹测定测定肺组织EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白表达.
 
　　1．2．5肺组织病理变化处死动物后，取肺组织置于60 g/L固定24 h，常规制备病理切片，HE染色后观察肺组织病理变化. 结果为细胞核呈蓝黑色，胞质呈淡红色. 参照文献［2］关于气道各层的定义，采用德国Leica Q500 MC图像分析系统，测定不含软骨的完整气管横断面，分别以WAt/ Pbm， WAi/ Pbm， WAm/ Pbm表示气管总管壁厚度、内壁厚度及气道平滑肌厚度.
 
　　1．2.6小鼠肺组织EGFR免疫组织化学染色采用LSAB法. 处死小鼠后，取每只小鼠肺门支气管组织行免疫组织化学染色，随机计数50个支气管平滑肌细胞（每组共计数500个），结果判定：-为无棕色颗粒沉淀或棕色颗粒少量、稀疏；＋为细胞膜区域出现淡黄色颗粒沉淀；为细胞膜区域出现黄色颗粒沉淀；为细胞膜区域出现棕色颗粒沉淀.

　　统计学处理： 计量资料以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件，表1资料组间比较采用Kruskal Wallis检验，组间比较采用方差分析，免疫组化结果排成列联表，进行χ2检验.

　　2结果

　　2．1慢性哮喘小鼠肺组织病理变化及地塞米松的干预哮喘小鼠可见上皮细胞破坏,支气管、血管周围大量炎细胞浸润，以嗜酸粒细胞、淋巴细胞为主，地塞米松处理组炎症减轻，生理盐水处理组无变化. 图像分析显示，哮喘组小鼠气道壁、内壁、气道平滑肌层均增厚；地塞米松处理组小鼠气道壁总厚度、内壁、气道平滑肌层厚度明显薄于慢性哮喘组小鼠（P<0.01,表1）,与正常对照组相比，差别无统计学意义；生理盐水处理组与慢性哮喘组相比，差别无统计学意义.表1各组小鼠气道形态学参数比较