作者：曹阳,赖文莉,陈扬熙

【关键词】  正畸牙移动;三叉神经节;,ATP;,,P2X3受体

　　Change of P2X3 receptor expression in rat trigeminal ganglion during experimental tooth movement

　　【Abstract】 AIM: To investigate the change of P2X3 receptor expression in the trigeminal ganglion sensory neurons after the nociceptive stimulation by orthodontic tooth movement force. METHODS: Male SpragueDawley rats underwent the mimic orthodontic tooth movement. Immunohistochemistry and immunofluorescence were applied in studying the change of P2X3 receptor expression during experimental tooth movement. RESULTS: The proportion of P2X3 receptorpositive sensory neurons increased after giving force to the teeth of rats, to the peak 3 d later and returned to control values at 14 d. CONCLUSION: The P2X3 receptor expression is transiently upregulated and anterogradely transported in trigeminal primary sensory neurons in the process of orthodontic tooth movement. P2X3 receptor may play a role in the pathomechanism of nociceptive responses in primary sensory neurons during orthodontic clinic treatment.

　　【Keywords】 tooth movement; trigeminal ganglion; ATP; P2X3 receptor

　　【摘要】 目的: 研究正畸牙移动中加力后P2X3受体在三叉神经节的表达变化规律，以探讨P2X3受体在正畸牙移动疼痛机制中的作用. 方法: 以雄性SD大鼠为实验对象，模拟临床矫治的牙移动过程，应用免疫组织化学手段进行研究. 结果: 大鼠牙齿加力后,观察到三叉神经节神经元P2X3受体免疫反应阳性率增高，并呈现一定的时间规律：实验后1 d开始出现变化，实验后3 d达高峰，14 d后下降至与对照组基本一致. 结论: 大鼠牙移动过程中，三叉神经节内（TG）的P2X3受体表达变化是一过性变化,呈现短时上调的规律，时间与正畸牙移动疼痛时间一致.

　　【关键词】 正畸牙移动;三叉神经节; ATP;  P2X3受体

　　0引言

　　正畸临床治疗是通过对错位的牙，牙弓或颌骨施加一定的矫治力来达到畸形矫治的目的，伴随着很多机体的反应，疼痛的产生是正畸治疗中最常见问题之一. 研究发现三磷酸腺ATP及它的功能类似体在周围组织的炎症时使动物的疼痛行为加强［1］. 因此ATP及其嘌呤类受体P2X3被认为在组织和神经受损害后扮演伤害感受信息的初级传入及传导的角色［2］. 越来越多的证据表明P2X3受体参与伤害刺激的编码表达,P2X3受体是P2X受体的一个亚单位，P2X受体是ATP门控阳离子通道的一个家族［3］，它与细胞外的ATP结合后被激活［4］， P2X3受体基因是在1995年从感觉神经元cDNA文库中克隆出来的［3,5］，被特异的定位于感觉神经节的中小径的神经元如背根神经节、三叉神经节(trigeminal ganglion, TG)及节状神经节 ［3, 5-6］,当正畸加力使牙移动时，由于牙周膜，牙槽骨和牙龈等会发生组织改建，可以预料这些都将对外周神经有激惹，造成神经损伤，可能使细胞内的ATP向细胞外流动通过三叉神经细胞的.P2X3受体传导，从而导致患者出现疼痛不适等感觉异常. 本研究拟对正畸牙移动中加力后引起P2X3受体在三叉神经节的表达变化进行探索,为进一步研究P2X3受体在正畸疼痛机制中的作用奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料选用8 wk雄性SD大鼠（四川大学华西动物实验中心提供，所有实验动物符合国际实验动物要求）共84只,体质量200～250 g, 在安静环境中饲养48 h以上.随机分为3组：实验组：轻力（50 g）组及重力（100 g）组，按时间段各有7小组，每组4只. 空白对照组按时间段分7小组，每组4只. 采用盐酸氯胺酮（0.4 mg/100g）肌注麻醉. 将大鼠一侧上颌第一磨牙和前牙间用结扎丝拴正畸用NiTi螺旋弹簧（0.008＂×0.032＂)为防止弹簧脱落，在前牙唇面及轴角处磨出深约0.5~1.0 mm槽沟，便于结扎丝结扎. 测力计测力，建立轻力（50 g）及重力（100 g）正畸力作用下的牙移动模型. 分别于加力后4 h, 1, 2, 3, 5, 7和14 d定期处死. 处死后迅速取实验组和对照组同侧三叉神经节、液氮速冻保存，冰冻连续切片,片厚10 μm.吹干后零下20℃冰箱保存.

　　1.2方法

　　1.2.1免疫组织化学染色大鼠的三叉神经节冰冻切片，常规LsAB法. 第一抗体（Santa Cruz生物技术公司，美国）为亲和纯化的P2X3羊多克隆抗体(1∶100)；免疫荧光第二抗体(vector公司)为FITC标记兔抗山羊IgG(1∶100)，加二抗前程序同常规LsAB法. 阴性对照试验：①空白对照用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)取代一抗;②血清对照用正常羊血清取代一抗.

　　1.2.2图像分析各时间点的每只大鼠三叉神经节随机选取不相邻切片各三张,在明视野下计数免疫反应阳性神经元的总数量,计算其占节内神经元细胞总数的比例，得到每只大鼠的阳性神经元百分率，按每组4只大鼠，计算出平均百分率，并求得标准差.

　　统计学处理： 资料用SPSS 10.0软件进行实验组与对照组之间单因素方差统计分析.

　　2结果

　　2.1免疫组化染色镜下观察表明P2X3受体抗体标记的棕黄色阳性胞体均匀分布于下颌支,上颌支及眼支,的感觉神经元上, 主要为中小型神经元,直径从10～45 μm，部分大型神经元也有部分着色. DAB染色标记在细胞膜及细胞浆里的．阳性胞体染色深浅不一，部分细胞核部位着色浅或不着色，周围胞浆点状着色，信捷职称论文写作发表网，似菊花样. 部分细胞胞浆内染色致密均匀，只在中心部位略淡．胞体染色深浅与胞体大小无关(图1A，B).

　　2.2P2X3受体变化情况大鼠牙移动后,实验组P2X3免疫反应阳性在TG神经元中的表达明显上调并呈现出时程变化. 与对照组相比，实验组P2X3免疫反应阳性神经元的数量在刺激后4 h即有微弱增加，至第3日达到高峰（图1B, 图2B），此后逐渐减少，14 d后P2X3受体神经元阳性率与对照组相似. 而轻力组与重力组相比变化较小(表1).

　　A: 对照; B: 重力实验(3 d).

　　图1大鼠三叉神经节神经元P2X3受体阳性表达LsAB ×400（略）

　　A: 对照; B: 重力实验(3 d).

　　图2大鼠三叉神经节神经元P2X3受体阳性表达(免疫荧光)LsAB ×200（略）

　　表1实验组和对照组不同实验时间TG内P2X3阳性神经元比率（略）

　　aP<0.05, bP<0.01 vs对照.

　　2.3免疫荧光结果FITC标记的神经元细胞呈现绿色荧光, 主要标记在中小型细胞及部分大细胞,可见重力组3 d（图2B）的P2X3阳性神经元的密度较正常对照组(图2A)明显增加.

　　3讨论

　　3.1ATP，P2X3受体及三叉神经节ATP不仅存在于细胞内，也存在于细胞外. 细胞内的ATP为细胞膜上的各种离子泵提供能量；而细胞外的ATP在神经，肌肉等组织中的信息传递中起一定的作用. ATP从组织损伤的部位或一些病理状态的交感神经末端释放而作用于感觉神经末端的嘌呤受体已证实是引起疼痛开始的原因［7］. 在神经损伤后ATP和P2X3嘌呤受体在感觉神经元的超敏性及向中枢神经系统(CNS)传递疼痛信息中有重要的角色［8］. 已经有较多动物实验证明支持p2X3受体介导伤害感受的理论,特别是通过对P2X3基因敲除的大鼠的实验 ［9］,已经较明确了P2X3受体在大鼠的外周疼痛传入中的主要作用.

　　生理学研究表明头面部的伤害性信息是由三叉神经节中的中小径神经元传入的［10］，在正畸力作用下，牙周膜内出现张力区和压力区，即使使用轻微的力量，也能造成牙周组织的损伤,疼痛的刺激兴奋牙齿的外周伤害性感受器传导至初级感觉三叉神经节神经元后再传导至中枢神经. 本研究结果显示p2x3受体主要呈现在三叉