1.2.5S.pn体内清除时间测定将S.pn培养于C+Y培养基中，到其A620 nm>0.5，然后用无菌PBS稀释到菌密度为5×1010 cfu/L. 将48只BALB/c小鼠随机分为两组，分别注射100 μL野生株和缺陷株菌液. 分别在注射菌液后12, 24, 36, 48 h取小鼠心脏血，每个时间段6只小鼠，系列稀释后，野生菌株血标本接种于TSA血平板，缺陷菌株血标本接种于含氯霉素TSA血平板（2.5 mg/L）. 37℃，50 mL/L CO2孵箱培养24～48 h，菌落计数，观察细菌在体内被清除情况. 最终结果以6只老鼠血液中细菌计数的平均值表示.
统计学处理： 数据以x±s表示，方差齐同时采用配对t检验，方差不齐时采用t′检验，P<0.05为有统计意义. 小鼠毒力实验结果采用Longrank检验，以SAS统计软件进行分析.
2结果
2.1肺炎链球菌licD2缺陷菌株的获得利用插入复制失活的方式构建licD2缺陷菌株△licD2. PCR扩增出licD2基因约310 bp，然后用XbaⅠ, Sau3AⅠ和XbaⅠ,BglⅡ分别将licD2和pEVP3进行双酶切，胶回收目的片段(图1，Marker: Gene RulerTM 1 kb DNA Ladder)，连接后转于DH5α获得重组质粒pEVP3licD2. 用HindⅢ酶切pEVP3licD2后可见大、小(约310 bp)两个片段(图2A，Marker: ФX174DNA/HinfⅠ)；以pEVP3多克隆位点两侧测序引物，PCR鉴定表明pEVP3licD2在560 bp处有目的片段，而pEVP3因没有重组licD2基因片段，扩增出的片断长度仅有250 bp(图2B). 将pEVP3licD2转化S.pn 31203，从而得到licD2基因缺陷菌株△licD2. 用licD2上游引物与pEVP3多克隆位点下游测序引物进行PCR鉴定，pEVP3licD2和△licD2由于有licD2基因片段的插入，在560 bp±均可见目的片段，而31203和pEVP3则没有该片段的产物(图3). 转化试验发现： licD2缺陷后，其转化能力与其野生菌31203相比明显下降，甚至完全消失(表2).表2S.pn 31203和△licD2转化力比较（略）
2.2半定量RTPCR分别测定31203和△licD2几个毒力因子的mRNA水平，结果见图4和表3. RTPCR结果显示野生菌株和缺陷菌株的毒力基因lytA(254 bp), pspA(250 bp), ply(400 bp)和nanA(200 bp)都有一定量的表达，但△licD2的表达量较之野生菌明显下降.
2.3小鼠毒力野生菌株半数致死时间<1 d，而缺陷菌株半数致死时间>14 d. 两者毒力具有显著性差异（Longrank分析： χ2=43.98, P<0.001）.
2.4S.pn体内清除时间测定在注射野生株菌液后48 h，小鼠体内仍有较高的细菌密度，而缺陷菌在小鼠体内经36 h后大部分都已被清除，经48 h 后体内的缺陷菌几乎完全被清除, 缺陷菌的清除速度明显快于野生菌(表4). 表4S.pn在小鼠体内清除情况（略）
3讨论
基因缺失技术是目前研究基因功能的最佳方法，而插入复制失活方式是在对细菌基因功能研究中常采用的方式. 这种方式主要是利用携带有目的基因某一段序列的穿梭质粒，通过同源重组方式整合到宿主菌染色体上，从而使该基因断裂，不能产生活性产物，根据穿梭质粒上的抗性标记，就可以筛选出缺陷菌株. 这种方式简单易行，本研究就是将licD2基因的一段序列克隆到穿梭质粒上pEVP3上，再转化肺炎链球菌，从含有氯霉素的血平板上得到了缺陷菌株.
从几种毒力基因的mRNA表达来看，胆碱缺陷后几种毒力因子的表达均下降，其中不仅有CBPs类的毒力因子LytA和PspA，还有非CBPs类的毒力因子Ply和NanA. LytA使链球菌自溶从而释放出内部的各种因子，触发宿主炎症反应等［7］. PspA可减少补体在细菌表面沉积，利于细菌在体内增殖［7］. Ply是一种存在于胞质中的多功能蛋白毒素，一般认为Ply在LytA诱导细菌自溶后才被释放，能引起细胞溶解，激活补体等多种效应，其作用属于膜损伤类毒素，可造成细胞损伤［8］. NanA位于细菌表面，能清除细胞表面的多糖如黏蛋白、糖脂和糖蛋白，破坏宿主细胞的糖苷，促进细菌定植后向宿主侵袭［7］. 这些毒力因子都在S.pn致病过程中发挥着重要作用，而licD2缺陷后这些对链球菌黏附、侵袭具有重要作用的毒力因子表达量都明显下降，这可能是细菌毒力下降的原因之一.
从小鼠毒力实验的结果来看，licD2缺陷菌致病力显著降低，小鼠存活时间明显延长；licD2缺陷菌在小鼠体内的浓度也明显低于野生菌，说明缺陷菌在体内很快被巨噬细胞等清除，难以像野生菌一样在体内大量存活. 而S.pn引起肺炎、脑膜炎等疾病都必须先黏附于内皮细胞再侵袭进入到宿主细胞内，一旦体内存活的细菌减少，能够黏附侵袭到宿主的细菌也会相应减少，很难再进一步引发其他疾病. 这也揭示了胆碱缺陷后S.pn毒力下降的一个重要原因.
licD2缺陷后细菌的转化力明显下降甚至消失. S.pn的转化调控着一大批基因的表达，当进入感受态后，可启动相当量蛋白表达，同时也有大量的蛋白表达被关闭［9］. 最近的研究发现S.pn转化缺陷菌株的LytA, NanA, 透明质酸酶三种毒力因子的表达较野生菌株减弱，提示细菌的转化有利于其毒力基因的表达［10］. 这说明licD2缺陷不仅直接造成几种重要毒力因子的表达下降，还有可能通过影响S.pn的转化力来间接影响细菌毒力.
本研究结果表明licD2基因从多方面影响着细菌毒力，为从基因的角度研究胆碱在链球菌致病过程中的重要作用提供了最基本的实验依据. 而其与细菌自然转化的密切联系提示其可能与肺炎链球菌的条件致病相关，为进一步研究肺炎链球菌条件致病的发病机制提供了新的思路.
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