【摘要】 目的：探讨脉冲电磁场（PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的影响. 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对其进行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色. 结果：rMSCs经PEMFs刺激后，各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高，差异具有统计学意义（P<0.05），其中1 Hz，0.4 mT组改变最为明显（3 d，0.323±0.051；5 d，0.714±0.058），对照组（3 d，0.246±0.044；5 d，0.487±0.064），差异具有统计学意义（P<0.01）；碱性磷酸酶检测实验组水平升高（5 d，0.348±0.032；15 d，2.339±0.034），对照组（5 d， 0.205±0.026；15 d，0.533±0.013），差异具有统计学意义（P<0.05）， 四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性. 结论：rMSCs经PEMFs刺激后，能促进体外培养rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁场参数对实验结果有影响.
【关键词】 脉冲电磁场；骨髓间充质干细胞；增殖；成骨细胞
0引言
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基质系统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱［1-3］. 脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs) 能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性［4］，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病［5］. 近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12 Hz，1.1 mT的PEMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性［6］. 利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化［7］. 本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEMFs对rMSCs产生的影响.
1材料和方法
1.1材料
SD仔鼠，12～15 d，体质量30～35 g，第四军医大学实验动物中心提供. 骨愈合刺激仪（第四军医大学生物医学工程系研制，ZL.0224739.4），治疗频率为15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美国Hyclone公司）；胎牛血清（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；胰蛋白酶，茜素红S（美国Sigma公司）；盐酸四环素胶囊（西安利君制药股份有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）.
1.2方法
1.2.1rMSC的体外分离培养
断颈处死大鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨. 在PBS中将骨剪成1～2 mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬浮于4 mL低糖DMEM中. 72 h后换液.
1.2.2rMSCs生物学特性鉴定
进行PAS?过碘酸雪夫氏染色、油红?O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色.
1.2.3rMSCs生长曲线的绘制
将原代细胞以5×106 cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线. 将第3代细胞以1×104 cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线.
1.2.4刺激方法
PEMFs发生仪频率：15 Hz，1 Hz；磁感应强度：0～0.8 mT可调；线圈直径：200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间. 刺激时间为每次3 h，1次/d.
1.2.5MTT法检测
细胞增殖将rMSCs以1×104 cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔. 刺激方式为：T0组(对照组)；T1组(15 Hz，0.2 mT)；T2组(15 Hz，0.4 mT)；T3组(15 Hz，0.8 mT)；T4组(1 Hz，0.2 mT)；T5组(1 Hz，0.4 mT)；T6组(1 Hz，0.8 mT)，连续作用5 d. 接种第2日开始PEMFs作用. 第3日每板选择16孔，加MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测定490 nm波长时各孔的吸光度A值. 第5日对其余孔做同样检测.
1.2.6ALP活性检测
将rMSCs以每孔1×104 cells/mL接种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板. 刺激方式为：T0组(对照组)，T1组(1 Hz，0.4 mT). 接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15 d. 第3日选两个板，测定ALP活性. 第5日和第15日各检测2个板.
1.2.7四环素荧光标记
将rMSCs以3×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 第2日开始对实验组进行PEMFs刺激，每天刺激结束后，关闭仪器电源，将对照组放在相同位置相同时间. 培养18 d后对细胞进行四环素荧光标记. 荧光显微镜下观察并采集图像.
1.2.8钙结节染色
将rMSCs以5×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 接种第2日开始PEMFs作用，对照组处理同前. 28 d后，用茜素红S染液进行钙结节染色. 倒置显微镜下观察并采集图像.
统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行分析，采用SNK?q检验和方差分析. 以P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1形态学观察及生物学鉴定
接种前3 d可见大量大小不一，圆形悬浮细胞. 第5日大部分细胞呈成纤维细胞样，第7日后，可见梭形细胞，部分形成集落，排列呈规则的辐射状. 经2～3次纯化处理，细胞形态趋于单一化，以梭形、三角形为主，呈集落生长趋势（图1）. 染色结果均为阴性，说明细胞不能分泌糖原、未向脂肪细胞及成骨细胞分化.
2.2rMSCs生长曲线的绘制
细胞生长曲线呈“S”形，具有稳定的潜伏期、对数增长期和平台期. 可见传代细胞生长周期明显比原代细胞短（图2）.
2．3PEMFs对rMSCs增殖水平的影响
PEMFs刺激3 d后，T1，T2，T4与对照组A值分别为0.265±0.063，0.260±0.059，0.266±0.057和0.246±0.044，组间差异均无统计学意义（P>0.05）. T3，信捷职称论文写作发表网，T5和T6组A值分别为0.288±0.060，0.323±0.051和0.300±0.042，与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05），以T5最为明显. PEMFs刺激5 d后，各实验组和对照组组间差异均具有统计学意义（P<0.05），T5，T6和对照组A值分别为0.714±0.058， 0.720±0.069和0.487±0.064，组间差异比较均具有统计学意义（P<0.01）.
2.4ALP活性检测经
PEMFs刺激后，实验组与对照组A值3 d为0.225±0.017和0.185±0.025，差异无统计学意义（P>0.05）；5 d为0.348±0.032和0.205±0.026，差异具有统计学意义（P<0.05）；15 d为2.339±0.034和0.533±0.013，差异具有统计学意义（P<0.01）.
2.5四环素荧光标记
细胞8 d左右呈梭形分布，并出现融合，约16 d左右出现结节状物. 继续培养可见复层生长. 持续培养，中心出现圆形细胞结节. 培养21 d时，尚无明显钙结节出现. 但四环素荧光标记后，镜下细胞周围基质聚集区呈明亮的黄色荧光区，阳性面积约占（10.1±1.2）%；对照组阳性面积约占（2.3±0.7）%. 两者之间差异具有统计学意义（P<0.01，图3）.
2.6钙结节染色结果
持续培养32 d后进行钙结节染色，可见钙结节成橘红色，大小、形态各不相同，边界清晰，呈火山状突起，中间有黑色不透光颗粒，周围为橘红色，由中间向周边颜色逐渐变浅，阳性面积约占（15.3±0.6）%；对照组阳性面积约占（9.6±0.8）%. 两者之间有显著差异（P<0.01，图4）.
3讨论
本实验采用全骨髓贴壁法，在冲洗骨髓腔时某些滋养细胞和细胞因子会同时被冲出，与MSCs一同培养，可促使MSCs生长增殖旺盛，活力相对较强. 目前该类方法通常采用的是成年大鼠，虽然成年大鼠可以获得较多的骨髓量，操作也相对方便，但成年大鼠体内MSCs的含量更少，增殖能力也较年幼的动物差，为此，我们采用了12～15 d的大鼠. 根据生长曲线，选取3～4 d的传代细胞用于实验. MTT实验
