结核分枝杆菌Mtb8.4DNA疫苗构建及免疫保护研究(2)
作者：佚名； 更新时间：2014-12-13
ery Kit回收，命名为hIL-2s。
4）将pVAX1质粒DNA经NheⅠ和HindⅢ双酶切，并回收目的片段。
5）设计合成扩增Mtb8.4基因引物:Mtb8.4-P1:5’-A TAT AAG CTT GCC GCC GCC ATG AGG CTG TCG TTG ACC GCA-3’（40mer）。下划线部分为HindⅢ酶切位点。斜体部分GCC GCC GCC为Kozak序列，该序列位于启始密码子前有利于抗原的高效表达。含有起始密码子ATG。Mtb8.4-P2:5’-GCG GGT ACC CTAGAA TTC ATA GTT GTT GCA GGA GCC GGC-3’（39mer）。下划线部分为KpnⅠ酶切位点。双下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。斜体部分为终止密码子。Mtb8.4-P1和Mtb8.4-P2的位置分别是969～989位和1279～1299位碱基序列，见H37RV RV1174C Gen-bank Accession number:CAA15851 ［8，9］ 。扩增产物为结核菌Mtb8.4的基因成熟蛋白编码区。
6）用Mtb8.4-P1和P2扩增结核菌Mtb8.4，用EcoRⅠ/ApaⅠ分别进行酶切，酶切产物使用PCR Fragment Recovery Kit切胶回收即TB-V6-1。
7）使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将hlL-2s连接到pVAX1载体，hlL-2s和TB-V6-1连接后再插入pVAX1载体，分别热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板过夜培养菌体。
8）挑选菌落，提取质粒，将插入Mtb8.4的质粒被命名为pVS84。将仅插入hlL-2信号肽的质粒命名为plL2S。
9）质粒pVS84用NheⅠ/BamHⅠ酶切检测。
10）用引物T7Promoter/pcDNA R对质粒pVS84和plL2S进行DNA测序。
图1 pVS84疫苗基因的位置、构建及酶切示意图（略）
Fig1 Target gene position，construction procedure and endonuclease sites of pVS84.
1.2.3 质粒DNA的提取及纯化 见文献 ［5］ 。
1.2.4 C57BL/6的分组及免疫程序 共分pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击试验。免疫方法为将各种质粒浓缩制剂用pH7.2的无热源0.1MPBS稀释至1000μg/ml，每只小鼠取0.1ml分四点注射入腿部肌肉内，pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30d分别免疫或者注射一次，共3次。BCG皮内注射免疫，每只小鼠10 5 个CFU。只免疫一次。
1.2.5 小鼠脾淋巴细胞培养及上清收集 免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMl1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMl1640完全培养基配制成10 6 /ml，接种于24孔培养板，5%CO 2 环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。
1.2.6 细胞因子的定量测定 以mIL-10定量检测为例。1）将小鼠血清、标准品（mlL-10:1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml）、标准品稀释液（作空白对照用）和质控品复溶液各100μl加入微孔内，均作复孔。2）将生物素标记的抗mIL-10抗体用生物素化抗体稀释液1:27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。3） 置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液洗1min，共洗涤3次。4）将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔（含空白孔），37℃放置30min。5）同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。6）各孔加入100μl2M硫酸终止反应，用酶免疫读数仪测OD450。7）标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIL-10的含量。
1.2.7 H37Rv感染C57BL/6小鼠 将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20d，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，（相当于2×10 7 CFU/ml），冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30d，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源、无菌生理盐水将H37Rv菌配制成10 7 CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml（10 6 个结核菌）感染小鼠。
1.2.8 感染鼠的组织器官的结核菌培养及计数 小鼠感染结核菌后喂养15d后杀鼠，取肝、肺和脾无菌取出、称重、制备成匀浆，取0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官接种个接种3管，37℃培养20～30d后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。
S（CFU）=C×（0+V）/O×10
C:3个L-J培养管出现的菌落数的均数;
10:接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数;O:为器官的重量（g）;
V:为加入生理盐水的体积，1ml=lg;
S:为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g
1.2.9 统计学处理 pVS84疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。
2 结果
2.1 表达结核菌Mtb8.4蛋白表达载体的构建及鉴定 从结核菌基因组DNA中扩增Mtb8.4DNA大小，连接后形成的表达质粒的大小及与各种酶切反应的大小相符。在DNA序列中，由于连接的需要，插入了酶切位置，序列为AAG CTT（HindⅢ），其表达蛋白则增加了Lys-Leu2个aa，与设计相符合。其余部分基因测序的结果表明与已公布的序列完全一致 ［8，9］ 。见图2。
2.2 结核菌DNA疫苗的含量及纯度 提取的pVS84疫苗、pVAXl和plL2S用紫外分光光度计测得的OD 260 /OD 280 的比值为1.726、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1324.4、1234.3和1356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。
2.3 免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比 pVS84免疫组的C57BL/6小鼠血清平均hlL-2与BCG免疫对照组、plL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均hlL-2含量无显著性差异。其脾淋巴细胞培养上清mIL-2和mlFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度无显著性差异，且显著高于pIL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均浓度（P<0.001）。培养上清中的mIL-6和mIl-10的平均浓度在5个组中间无显著性差异。见表1。
2.4 免疫组和对照组小鼠的脾、肝和肺的结核菌落数对比 pVS84免疫C57BL/6小鼠的脾、肝和肺组织培养的菌落均数均显著高于阴性或者空白对照组的结核菌载量（Bacterial load），而除免疫组脾脏结核菌显著高于BCG免疫组的相应器官的细菌载量（P<0.001）外，pVS84免疫组的肝和肺的结核菌载量与BCG免疫组之间无显著性差异（P>0.05）。见表2。
图2 插入的基因，质粒及质粒的酶切产物电泳图（略）
M，DNAmarker;1.hIL-2信号序列基因片段，约80bp;2.Mtb8.4基因PCR产物，330bp;3.Mtb8.4基因PCR产物酶切回收片段330bp;4.pVS84质粒，3410bp;5.pVS84质粒NheⅠ/KpnⅠ双酶切片段约3000bp和410bp。
Fig2 Electrophoresis of product of inserted gene，plasmid and en-zyme-digested plasmid
M，DNA marker;1.hIL-2signal peptide gene fragment，80bp.2.PCR product of mtb8.4，330bp;3.MTB mtb8.4fragment after HindⅢ/KpnⅠdigestions;4.Expressing vector of pVS84，3400bp;5.pVS84fragment after KpnⅠ/NheⅠdigestions，3000and410bp respectively.
表1 结核菌DNA疫苗免疫后脾细胞培养上清细胞因子含量对比（略）
Table1 The concentrations of CKS in the sera or culture supernatants of the splenocytes of TB DNA vaccine immunized mice and the controls
※与pVS84及BCG免疫组比较，差异均有非常显著性（P<0.001）。其余两组间比较，差异均无显著性。
表2 结核DNA疫苗及对照组免疫小鼠的内脏组织培养的结核菌落数比较（略）
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in the spleen，liver and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control groups
结果采
4）将pVAX1质粒DNA经NheⅠ和HindⅢ双酶切，并回收目的片段。
5）设计合成扩增Mtb8.4基因引物:Mtb8.4-P1:5’-A TAT AAG CTT GCC GCC GCC ATG AGG CTG TCG TTG ACC GCA-3’（40mer）。下划线部分为HindⅢ酶切位点。斜体部分GCC GCC GCC为Kozak序列，该序列位于启始密码子前有利于抗原的高效表达。含有起始密码子ATG。Mtb8.4-P2:5’-GCG GGT ACC CTAGAA TTC ATA GTT GTT GCA GGA GCC GGC-3’（39mer）。下划线部分为KpnⅠ酶切位点。双下划线部分为EcoRⅠ酶切位点。斜体部分为终止密码子。Mtb8.4-P1和Mtb8.4-P2的位置分别是969～989位和1279～1299位碱基序列，见H37RV RV1174C Gen-bank Accession number:CAA15851 ［8，9］ 。扩增产物为结核菌Mtb8.4的基因成熟蛋白编码区。
6）用Mtb8.4-P1和P2扩增结核菌Mtb8.4，用EcoRⅠ/ApaⅠ分别进行酶切，酶切产物使用PCR Fragment Recovery Kit切胶回收即TB-V6-1。
7）使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将hlL-2s连接到pVAX1载体，hlL-2s和TB-V6-1连接后再插入pVAX1载体，分别热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板过夜培养菌体。
8）挑选菌落，提取质粒，将插入Mtb8.4的质粒被命名为pVS84。将仅插入hlL-2信号肽的质粒命名为plL2S。
9）质粒pVS84用NheⅠ/BamHⅠ酶切检测。
10）用引物T7Promoter/pcDNA R对质粒pVS84和plL2S进行DNA测序。
图1 pVS84疫苗基因的位置、构建及酶切示意图（略）
Fig1 Target gene position，construction procedure and endonuclease sites of pVS84.
1.2.3 质粒DNA的提取及纯化 见文献 ［5］ 。
1.2.4 C57BL/6的分组及免疫程序 共分pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击试验。免疫方法为将各种质粒浓缩制剂用pH7.2的无热源0.1MPBS稀释至1000μg/ml，每只小鼠取0.1ml分四点注射入腿部肌肉内，pVS84免疫组、pVAXl注射组、plL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30d分别免疫或者注射一次，共3次。BCG皮内注射免疫，每只小鼠10 5 个CFU。只免疫一次。
1.2.5 小鼠脾淋巴细胞培养及上清收集 免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMl1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMl1640完全培养基配制成10 6 /ml，接种于24孔培养板，5%CO 2 环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。
1.2.6 细胞因子的定量测定 以mIL-10定量检测为例。1）将小鼠血清、标准品（mlL-10:1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml）、标准品稀释液（作空白对照用）和质控品复溶液各100μl加入微孔内，均作复孔。2）将生物素标记的抗mIL-10抗体用生物素化抗体稀释液1:27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。3） 置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液洗1min，共洗涤3次。4）将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔（含空白孔），37℃放置30min。5）同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。6）各孔加入100μl2M硫酸终止反应，用酶免疫读数仪测OD450。7）标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIL-10的含量。
1.2.7 H37Rv感染C57BL/6小鼠 将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20d，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，（相当于2×10 7 CFU/ml），冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30d，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源、无菌生理盐水将H37Rv菌配制成10 7 CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml（10 6 个结核菌）感染小鼠。
1.2.8 感染鼠的组织器官的结核菌培养及计数 小鼠感染结核菌后喂养15d后杀鼠，取肝、肺和脾无菌取出、称重、制备成匀浆，取0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官接种个接种3管，37℃培养20～30d后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。
S（CFU）=C×（0+V）/O×10
C:3个L-J培养管出现的菌落数的均数;
10:接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数;O:为器官的重量（g）;
V:为加入生理盐水的体积，1ml=lg;
S:为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g
1.2.9 统计学处理 pVS84疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。
2 结果
2.1 表达结核菌Mtb8.4蛋白表达载体的构建及鉴定 从结核菌基因组DNA中扩增Mtb8.4DNA大小，连接后形成的表达质粒的大小及与各种酶切反应的大小相符。在DNA序列中，由于连接的需要，插入了酶切位置，序列为AAG CTT（HindⅢ），其表达蛋白则增加了Lys-Leu2个aa，与设计相符合。其余部分基因测序的结果表明与已公布的序列完全一致 ［8，9］ 。见图2。
2.2 结核菌DNA疫苗的含量及纯度 提取的pVS84疫苗、pVAXl和plL2S用紫外分光光度计测得的OD 260 /OD 280 的比值为1.726、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1324.4、1234.3和1356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。
2.3 免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比 pVS84免疫组的C57BL/6小鼠血清平均hlL-2与BCG免疫对照组、plL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均hlL-2含量无显著性差异。其脾淋巴细胞培养上清mIL-2和mlFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度无显著性差异，且显著高于pIL2s、pVAXl和PBS等3个阴性对照组的平均浓度（P<0.001）。培养上清中的mIL-6和mIl-10的平均浓度在5个组中间无显著性差异。见表1。
2.4 免疫组和对照组小鼠的脾、肝和肺的结核菌落数对比 pVS84免疫C57BL/6小鼠的脾、肝和肺组织培养的菌落均数均显著高于阴性或者空白对照组的结核菌载量（Bacterial load），而除免疫组脾脏结核菌显著高于BCG免疫组的相应器官的细菌载量（P<0.001）外，pVS84免疫组的肝和肺的结核菌载量与BCG免疫组之间无显著性差异（P>0.05）。见表2。
图2 插入的基因，质粒及质粒的酶切产物电泳图（略）
M，DNAmarker;1.hIL-2信号序列基因片段，约80bp;2.Mtb8.4基因PCR产物，330bp;3.Mtb8.4基因PCR产物酶切回收片段330bp;4.pVS84质粒，3410bp;5.pVS84质粒NheⅠ/KpnⅠ双酶切片段约3000bp和410bp。
Fig2 Electrophoresis of product of inserted gene，plasmid and en-zyme-digested plasmid
M，DNA marker;1.hIL-2signal peptide gene fragment，80bp.2.PCR product of mtb8.4，330bp;3.MTB mtb8.4fragment after HindⅢ/KpnⅠdigestions;4.Expressing vector of pVS84，3400bp;5.pVS84fragment after KpnⅠ/NheⅠdigestions，3000and410bp respectively.
表1 结核菌DNA疫苗免疫后脾细胞培养上清细胞因子含量对比（略）
Table1 The concentrations of CKS in the sera or culture supernatants of the splenocytes of TB DNA vaccine immunized mice and the controls
※与pVS84及BCG免疫组比较，差异均有非常显著性（P<0.001）。其余两组间比较，差异均无显著性。
表2 结核DNA疫苗及对照组免疫小鼠的内脏组织培养的结核菌落数比较（略）
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in the spleen，liver and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control groups
结果采
