结核分枝杆菌Mtb8.4DNA疫苗构建及免疫保护研究(3)
作者：佚名； 更新时间：2014-12-13
用M±SD表示。单位为CFU/g。
*表示与pVS84比较，细菌载量低于阴性对照组差异有显著性;**表示BCG免疫组细菌载量既低于阴性对照组又低于pVS84免疫组差异有显著性。
表3 结核DNA疫苗及对照免疫小鼠的内脏培养结核菌落数对数值比较（略）
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in log units in the spleens，livers and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control mice
从表3中可以看出，结核DNA疫苗pVS84免疫的C57BL/6小鼠的脾、肝和肺淋巴细胞载量的对数值比阴性对照组（plL2S、pVAX1和PBS）分别下降0.2，0.5和0.4个对数单位（log10）。而BCG免疫对照组的相应器官的结核菌载量分别下降0.8，0.6和0.7个log10对数单位。两组下降的幅度非常接近。
各组动物的脾、肝和肺的结核菌生长情况从小鼠脾脏分离的结核菌落显示发现，仅表达hIL-2信号肽的载体（pIL2S）（B）、pVAX1（C）和PBS（D）注射C57BL/6小鼠后，H37Rv攻击后15d脾脏悬液培养H37Rv结果，可见L-J斜面上菌落密布。pVS84（A）和BCG（E）免疫后，脾淋巴细胞培养，斜面上菌落明显减少。
3 讨论
由于BCG预防TB效果的不确定性，世界各国一直未放弃对新型结核疫苗进行的研发。从目前的发展的近况看，主要存在以下三个技术路线。一是减毒活分枝杆菌疫苗。基因操作技术的发展激起了一系列增强现正使用的BCG效用的尝试。使生物合成通路相关的基因灭活产生的营养缺陷型突变株比BCG安全，而且不受干扰 ［10，11］ 。BCG的免疫性可以通过导入编码哺乳动物的细胞因子如INF-γ或细胞因子的拮抗剂 ［12，13］ 。减毒活分枝杆菌疫苗的缺陷是加速疫苗的清除，对免疫回忆反应造成重大伤害。保护性抗原的加强表达是加强BCG免疫原性的另一种方法。携带多拷贝表达分泌性抗原Ag85B的BCG株在豚鼠模型中显示有保护作用增强 ［14］ 。70kDa热休克蛋白（heatshock protein）转入BCG后具有近似的效果 ［15］ ;二是结核菌减毒株的疫苗作用研究。减毒结核菌株的免疫效果优于BCG。改变结核菌的表面性质，破坏调控基因和营养缺陷变异株实验的结果更令人鼓舞 ［16］ 。挑选可干扰感染不同阶段的突变株，可以使免疫原性最优，诱导免疫记忆而且可消除不良后果。可以乐观地估计，达到上述效果，且比自然感染更好免疫原性的菌株是完全可能的。利用减毒活结核菌作为疫苗最大的隐忧是造成免疫缺陷病人结核菌感染;三是亚单位疫苗研究。核酸疫苗（nucleic acid vaccine）包括DNA疫苗（DNA vaccine）和RNA疫苗（RNA vaccine），由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成，将其直接导入机体细胞后，并不与宿主染色体整合，而是通过宿主细胞转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗（genetic vaccine）、基因免疫（genetic immuniza-tion）或核酸免疫（nucleic acid immunization），但目前研究最多的是DNA疫苗，由于其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗（naked DNA vaccine） ［17］ 。这是近年来自基因治疗研究中所衍生而发展的一项新技术、新领域，1995年4月美国纽约科学院称核酸疫苗是疫苗学的新纪元。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。
Coler等 ［8］ 研究抗原能否刺激健康献血者的外周血淋巴细胞增殖及产生IFN-γ，并进而研究其在动物模型中产生保护性免疫时发现Mtb8.4为T细胞识别抗原。Mtb8.4基因由330个核苷酸组成（编号Rv1174c;CAA15851），编码110个氨基酸（aa）的肽链，信号肽为28个aa（969-1025）。预测其成熟即无信号肽的分子量为8.4kDa，故编号为Mtb8.4。表达该抗原的DNA疫苗或其重组蛋白联合佐剂均能刺激产生强烈的CD 4+ T细胞和CD 8+ CTL应答，并能保护结核菌有毒株的攻击。他们以前的研究报告显示表达分支杆菌的MPT-63，MPT-83或ESAT-6的疫苗与对照组比较，肺组织的CFU的对数值只降低0.41-0.61。编码Mtb8.4抗原的DNA疫苗具有与多个DNA疫苗联合免疫的保护水平。重组Mtb8.4蛋白和Mtb8.4的DNA疫苗均可使肺组织结核菌CFU的对数值降低1 -1.2，与BCG免疫下降的程度相当。也证实表达Mtb8.4的质粒只诱导Thl型应答而不诱导体液免疫应答 ［9］。说明Mtb8.4抗原是良好的保护性抗原。因此选择该抗原作为我们疫苗的主要抗原。
由于已报道的结核DNA疫苗效果不理想，主要表现在免疫保护效果达不到BCG免疫的效果，因此，设计制备了表达结核菌蛋白Mtb8.4分泌蛋白的DNA疫苗pVS84。构建的DNA疫苗pVS84及表达hIL-2信号肽的质粒pIL2S经过菌斑筛选，抗生素抗性筛选、限制性内切酶鉴定及基因测序证明，构建的DNA疫苗及pIL2S质粒的基因序列与文献报道的一致 ［6～9］ ，符合设计要求（图1和2）。pVS84免疫小鼠后，其脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-2、mIFN-γ分别为379.6±58.2pg/ml和529.7±63.7pg/ml，显著高于pVAX1、pIL2S和PBS对照组（P<0.001），与BCG免疫对照组差异均无显著性。实验组和对照组脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-6和mIL-10浓度，每组之间均差异无显著性（P>0.05，见表1）。表明构建DNA疫苗pVS84可刺激机体产生Thl型免疫应答。
pVS84免疫C57BL/6小鼠组的脾、肝及肺的平均结核菌载量分别为（39176.9±3702.6）CFU/g、（18780.1±2535.8）CFU/g和（24410.3土1846.8）CFU/g，分别低于pYAX1、pIL2S和PBS等阴性对照组的相应器官的结核菌载量，差异具有显著性（P<0.001，见表2）。与BCG免疫小鼠的结核菌载量比较，3种免疫器官的平均细菌载量差异仍具有显著性。揭示本研究中构建的DNA疫苗pVS84免疫的小鼠具有抵抗标准结核菌株H37Rv经静脉攻击的能力，免疫保护作用显著。
本研究的结果表明，pVS84具有刺激机体产生的抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答的能力。小鼠经该疫苗免瘴后，抵抗结核菌H37Rv攻击的能力比对照组显著增强。此疫苗的免疫保护效果与BCG比较尚有差距，多个DNA疫苗或者与表达细胞因子联合免疫的效果如何值得深入研究。
参考文献:
［1］Dye C，Seheele S，Dolin P，et al.Global burden of tuberculosis.Estimated incidence，prevalence，and mortality by country［J］.JAMA，1999，282:677～686.
［2］Fine PEM.Variation in protection by BCG:implications of and for heterolo-gous immunity［J］.Lancet，1995，346:1339～1345.
［3］Huygen K.On the Use of DNA vaccines for the prophylaxis of mycobacterial diseases［J］.Infect lmmun，2003，7:1613～1621.
［4］朱中元，王海波，谢勇，等.结核分枝杆菌inhA基因突变的测序研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24:48～51.
［5］萨姆布鲁克J.，D.W.拉塞尔，著.黄培堂，等.译.分子克隆实验指南（第3版）［M］.北京:科学出版社，2002，23～59.
［6］Gareia-Lora A，Martinez M，Pedrinaei S，et al.Different regulation of PKC isoenzymes andMAPK by PSK and IL-2in the proliferative and cyto-toxic activities of the NKL human natural killer cell line［J］.Cancer Im-munol Immunother，2003，52，59～64.
［7］Jiang K，Zhong B，Ritehey C，et al.Regulation of Akt-dependent cell survival by Syk and Rac［J］.Blood，2003，101:236～244.
［8］Coler R N，Skeiky YA，Vedviek T，et al.Molecular cloning and immuno-logical reactivity of a novel low molecular mass antigen of Mycobactorium tuberculosis［J］.J Immunol，19
*表示与pVS84比较，细菌载量低于阴性对照组差异有显著性;**表示BCG免疫组细菌载量既低于阴性对照组又低于pVS84免疫组差异有显著性。
表3 结核DNA疫苗及对照免疫小鼠的内脏培养结核菌落数对数值比较（略）
Table2 The Mtuberculosis bacterium loads in log units in the spleens，livers and lungs of the TB DNA plasmid injected mice and control mice
从表3中可以看出，结核DNA疫苗pVS84免疫的C57BL/6小鼠的脾、肝和肺淋巴细胞载量的对数值比阴性对照组（plL2S、pVAX1和PBS）分别下降0.2，0.5和0.4个对数单位（log10）。而BCG免疫对照组的相应器官的结核菌载量分别下降0.8，0.6和0.7个log10对数单位。两组下降的幅度非常接近。
各组动物的脾、肝和肺的结核菌生长情况从小鼠脾脏分离的结核菌落显示发现，仅表达hIL-2信号肽的载体（pIL2S）（B）、pVAX1（C）和PBS（D）注射C57BL/6小鼠后，H37Rv攻击后15d脾脏悬液培养H37Rv结果，可见L-J斜面上菌落密布。pVS84（A）和BCG（E）免疫后，脾淋巴细胞培养，斜面上菌落明显减少。
3 讨论
由于BCG预防TB效果的不确定性，世界各国一直未放弃对新型结核疫苗进行的研发。从目前的发展的近况看，主要存在以下三个技术路线。一是减毒活分枝杆菌疫苗。基因操作技术的发展激起了一系列增强现正使用的BCG效用的尝试。使生物合成通路相关的基因灭活产生的营养缺陷型突变株比BCG安全，而且不受干扰 ［10，11］ 。BCG的免疫性可以通过导入编码哺乳动物的细胞因子如INF-γ或细胞因子的拮抗剂 ［12，13］ 。减毒活分枝杆菌疫苗的缺陷是加速疫苗的清除，对免疫回忆反应造成重大伤害。保护性抗原的加强表达是加强BCG免疫原性的另一种方法。携带多拷贝表达分泌性抗原Ag85B的BCG株在豚鼠模型中显示有保护作用增强 ［14］ 。70kDa热休克蛋白（heatshock protein）转入BCG后具有近似的效果 ［15］ ;二是结核菌减毒株的疫苗作用研究。减毒结核菌株的免疫效果优于BCG。改变结核菌的表面性质，破坏调控基因和营养缺陷变异株实验的结果更令人鼓舞 ［16］ 。挑选可干扰感染不同阶段的突变株，可以使免疫原性最优，诱导免疫记忆而且可消除不良后果。可以乐观地估计，达到上述效果，且比自然感染更好免疫原性的菌株是完全可能的。利用减毒活结核菌作为疫苗最大的隐忧是造成免疫缺陷病人结核菌感染;三是亚单位疫苗研究。核酸疫苗（nucleic acid vaccine）包括DNA疫苗（DNA vaccine）和RNA疫苗（RNA vaccine），由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成，将其直接导入机体细胞后，并不与宿主染色体整合，而是通过宿主细胞转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗（genetic vaccine）、基因免疫（genetic immuniza-tion）或核酸免疫（nucleic acid immunization），但目前研究最多的是DNA疫苗，由于其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗（naked DNA vaccine） ［17］ 。这是近年来自基因治疗研究中所衍生而发展的一项新技术、新领域，1995年4月美国纽约科学院称核酸疫苗是疫苗学的新纪元。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。
Coler等 ［8］ 研究抗原能否刺激健康献血者的外周血淋巴细胞增殖及产生IFN-γ，并进而研究其在动物模型中产生保护性免疫时发现Mtb8.4为T细胞识别抗原。Mtb8.4基因由330个核苷酸组成（编号Rv1174c;CAA15851），编码110个氨基酸（aa）的肽链，信号肽为28个aa（969-1025）。预测其成熟即无信号肽的分子量为8.4kDa，故编号为Mtb8.4。表达该抗原的DNA疫苗或其重组蛋白联合佐剂均能刺激产生强烈的CD 4+ T细胞和CD 8+ CTL应答，并能保护结核菌有毒株的攻击。他们以前的研究报告显示表达分支杆菌的MPT-63，MPT-83或ESAT-6的疫苗与对照组比较，肺组织的CFU的对数值只降低0.41-0.61。编码Mtb8.4抗原的DNA疫苗具有与多个DNA疫苗联合免疫的保护水平。重组Mtb8.4蛋白和Mtb8.4的DNA疫苗均可使肺组织结核菌CFU的对数值降低1 -1.2，与BCG免疫下降的程度相当。也证实表达Mtb8.4的质粒只诱导Thl型应答而不诱导体液免疫应答 ［9］。说明Mtb8.4抗原是良好的保护性抗原。因此选择该抗原作为我们疫苗的主要抗原。
由于已报道的结核DNA疫苗效果不理想，主要表现在免疫保护效果达不到BCG免疫的效果，因此，设计制备了表达结核菌蛋白Mtb8.4分泌蛋白的DNA疫苗pVS84。构建的DNA疫苗pVS84及表达hIL-2信号肽的质粒pIL2S经过菌斑筛选，抗生素抗性筛选、限制性内切酶鉴定及基因测序证明，构建的DNA疫苗及pIL2S质粒的基因序列与文献报道的一致 ［6～9］ ，符合设计要求（图1和2）。pVS84免疫小鼠后，其脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-2、mIFN-γ分别为379.6±58.2pg/ml和529.7±63.7pg/ml，显著高于pVAX1、pIL2S和PBS对照组（P<0.001），与BCG免疫对照组差异均无显著性。实验组和对照组脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-6和mIL-10浓度，每组之间均差异无显著性（P>0.05，见表1）。表明构建DNA疫苗pVS84可刺激机体产生Thl型免疫应答。
pVS84免疫C57BL/6小鼠组的脾、肝及肺的平均结核菌载量分别为（39176.9±3702.6）CFU/g、（18780.1±2535.8）CFU/g和（24410.3土1846.8）CFU/g，分别低于pYAX1、pIL2S和PBS等阴性对照组的相应器官的结核菌载量，差异具有显著性（P<0.001，见表2）。与BCG免疫小鼠的结核菌载量比较，3种免疫器官的平均细菌载量差异仍具有显著性。揭示本研究中构建的DNA疫苗pVS84免疫的小鼠具有抵抗标准结核菌株H37Rv经静脉攻击的能力，免疫保护作用显著。
本研究的结果表明，pVS84具有刺激机体产生的抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答的能力。小鼠经该疫苗免瘴后，抵抗结核菌H37Rv攻击的能力比对照组显著增强。此疫苗的免疫保护效果与BCG比较尚有差距，多个DNA疫苗或者与表达细胞因子联合免疫的效果如何值得深入研究。
参考文献:
［1］Dye C，Seheele S，Dolin P，et al.Global burden of tuberculosis.Estimated incidence，prevalence，and mortality by country［J］.JAMA，1999，282:677～686.
［2］Fine PEM.Variation in protection by BCG:implications of and for heterolo-gous immunity［J］.Lancet，1995，346:1339～1345.
［3］Huygen K.On the Use of DNA vaccines for the prophylaxis of mycobacterial diseases［J］.Infect lmmun，2003，7:1613～1621.
［4］朱中元，王海波，谢勇，等.结核分枝杆菌inhA基因突变的测序研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24:48～51.
［5］萨姆布鲁克J.，D.W.拉塞尔，著.黄培堂，等.译.分子克隆实验指南（第3版）［M］.北京:科学出版社，2002，23～59.
［6］Gareia-Lora A，Martinez M，Pedrinaei S，et al.Different regulation of PKC isoenzymes andMAPK by PSK and IL-2in the proliferative and cyto-toxic activities of the NKL human natural killer cell line［J］.Cancer Im-munol Immunother，2003，52，59～64.
［7］Jiang K，Zhong B，Ritehey C，et al.Regulation of Akt-dependent cell survival by Syk and Rac［J］.Blood，2003，101:236～244.
［8］Coler R N，Skeiky YA，Vedviek T，et al.Molecular cloning and immuno-logical reactivity of a novel low molecular mass antigen of Mycobactorium tuberculosis［J］.J Immunol，19
