【关键词】  调节性T细胞；CD25；FOXP3；肠杆菌科；抗原

　　Expressions of CD25 and FOXP3 on human CD4+T cells before and after challenged by enteric bacterial antigens

　　【Abstract】  AIM:  To investigate expressions of CD25 and FOXP3 on human peripheral blood CD4+ T cells before and after activated by autologous enteric bacterial antigens. METHODS: Human peripheral blood lymphocytes and monocytes were isolated from 15 people. Some lymphocytes were cocultured for 14 d with monocytes which were previously challenged by bacterial antigens from autologous intestine. The CD4, CD25 and FOXP3 were measured by flow cytometry on the freshly isolated and the cocultured lymphocytes. RESULTS: Of the freshly isolated lymphocytes, about 43.4% expressed CD4. In the CD4+T cells, the percentages of CD25+, CD25hi, FOXP3+, CD25+FOXP3+, and CD25hiFOXP3+T cells were 5.8%, 1.9%, 5.2%, 3.3% and 1.6%, respectively.  After in vitro challenged by autologous bacterial antigens, the total number of lymphocytes slightly increased (by 21.0%, P<0.001 vs unchallenged cells). The percentage of CD4+T cells elevated significantly （67.1% vs 43.4%, P<0.001）, while the percentages of CD25+, FOXP3+ and CD25+FOXP3+ T cells did not change significantly. The CD4+CD25+FOXP3+T/CD4+CD25+T or CD4+CD25hiFOXP3+ T/CD4+CD25hi T cell ratio decreased (the former from 59.8% to 52.0%; the latter from 86.3% to 77.9%, both P<0.05). CONCLUSION: Both CD25 and CD25hi are not the reliable markers of human regulatory T cells, especially when activated in vitro by bacterial antigens.  The activation/proliferation of CD4+CD25+FOXP3- T reactive cells predominates that of CD4+CD25+FOXP3+T regulatory cells in response to the challenge of  autologous bacterial antigens.

　　【Keywords】 regulatory T cells; CD25; FOXP3; enteric bacteria; antigen

　　【摘要】 目的： 探讨新鲜分离及自身肠道菌群抗原刺激后的人外周血CD4+T细胞CD25和FOXP3表达的相关性及变化规律. 方法： 分离人的外周血单核细胞和淋巴细胞，单核细胞经自身肠道菌群抗原刺激后与淋巴细胞混合培养，新鲜分离及混合培养14 d的淋巴细胞用三色流式细胞术在单细胞水平同时检测CD4，CD25和FOXP3的表达. 结果： 新鲜分离的淋巴细胞约43.4%表达CD4，在CD4+T细胞中，约5.8%表达CD25，而高表达的只有1.9%，约5.2%表达FOXP3，CD25和FOXP3均表达的占3.3%，CD25hiFOXP3+细胞占1.6%，CD4-细胞几乎不表达FOXP3. 经抗原刺激后，淋巴细胞总数均轻度增加（与未刺激组比较，平均增加21.0%，P<0.001）. CD4+细胞的比例均明显上升（67.1% vs 43.4%, P<0.001），CD25+，FOXP3+及CD25+FOXP3+细胞的比例变化不大. CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+CD25+T细胞的比例及CD4+CD25hiFOXP3+T细胞占CD4+CD25hi T细胞的比例在所有研究对象中均呈下降趋势（前者从59.8%降到52.0%，后者从86.3%降到77.9%，均P<0.05）. 结论： CD25和FOXP3的表达具有一定的相关性，但CD25及CD25hi均不能很可靠地标记人类的调节性T细胞，尤其是在淋巴细胞受到抗原刺激以后. 肠道菌群抗原作为外来抗原刺激自身的淋巴细胞后，活化增殖的细胞中主要是CD4+CD25+FOXP3-反应性T细胞，而不是CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞.

　　【关键词】 调节性T细胞；CD25；FOXP3；肠杆菌科；抗原

　　0引言

　　近年有人用CD25的高表达（CD25hi）作为调节性T细胞的标记， FOXP3是位于细胞核内的转录因子， 难以用来在单细胞水平分离和鉴定调节性T细胞［1-2］. 我们分离人的外周血淋巴细胞， 在体外培养中加自身肠道菌群抗原， 然后用三色流式细胞术在单细胞水平同时检测CD4， CD25和FOXP3的表达变化.

　　1材料和方法

　　1.1材料人类调节性T细胞染色Kit购于eBioscience公司， 疱肉培养基基础及牛肉粒购于北京陆桥技术公司. RPMI 1640液、 胎牛血清、 HEPES及10×PBS购于Hyclone公司. LympholyteH液购于Cedarlane公司，Percoll液购于Amersham Bioscience公司. DNase I购于Takara公司. 考马斯亮蓝总蛋白定量试剂购于南京建成生物工程研究所. 研究对象共15人，年龄20~57岁，均做过电子肠镜检查，其中9人检查出大肠息肉. 用肝素抗凝管采外周血10 mL，10 min内用RPMI 1640（含10 mmol/L HEPES, 100 kU/L青霉素、30 mg/L庆大霉素） 10 mL稀释后加入2个15 mL离心管，用连接6号加长针头的注射器抽LympholyteH（1.077 kg/L），每管4 mL缓慢加在稀释血液下面，1200 r/min离心20 min，取灰白层单个核细胞悬液，PBS洗2次，用5 mL RPMI 1640（含100 mL/L胎牛血清, HEPES及双抗）混悬细胞，将低密度Percoll（1068 kg/L，335 mmol/L） 4 mL和高密度Percoll（1080 kg/L，335 mmol/L） 2 mL分层铺在细胞悬液下面，2000 r/min离心15 min，取低密度Percoll中段以上及至高密度Percoll中段的细胞悬液，分别作为单核细胞和淋巴细胞，PBS洗2次，苔盼蓝染色计数活细胞均在96%以上，取细胞悬液作离心涂片，WrightsGiemsa染色鉴定，淋巴细胞和单核细胞的纯度分别在97%和90%以上.

　　1.2方法每个研究对象于肠镜下取结肠标本，立即将其表面所带细菌接种到疱肉培养基50 mL中，液体石蜡封闭，37℃培养48 h，取菌液离心（4000 r/min，20 min）沉淀，加去离子水1.5 mL及DNase I混悬1667 nkat，冰上超声破碎，过滤除菌，考马斯亮蓝法测总蛋白浓度. 细胞培养基为约含100 mL/L自身血浆的RPMI 1640，血液第1次离心后取灰白层以上的液体10 mL，过滤除去血小板，加含双抗及HEPES的RPMI 1640至40 mL作为完全培养基. 单核细胞以1×105个/孔加入96孔板，并以20 mg/L加入自身来源的肠道厌氧菌群抗原，对照孔不加细菌抗原，16 h后每隔2 h半量换液1次，共4次，以稀释除去细菌抗原，然后按8×104/孔加入自身的淋巴细胞，隔天半量换液1次，混合培养的第14日计数细胞，并收集淋巴细胞做流式细胞检测. 分离2 d及混合培养14 d的淋巴细胞用于流式细胞检测CD4, CD25及FOXP3的表达. 操作按照试剂盒说明.统计学处理： 计量数据用x±s表示， 计算用SPSS 11.5完成， 前后比较采用配对样本的t检验， P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　新鲜分离的淋巴细胞约43.4%表达CD4，CD4+T细胞中约5.8%表达CD25，而高表达的只有1.9%，信捷职称论文写作发表网，CD4+T细胞中约5.2%的细胞表达FOXP3，CD25和FOXP3均表达的占3.3%，CD25hiFOXP3+细胞占1.6%，CD4-细胞几乎不表达FOXP3. 所有对象的淋巴细胞在体外培养中经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均轻度增加（与未刺激组比较平均增加21.0%，P<0.001）. CD4+细胞的比例明显上升（67.1%， P<0.001，表1），CD25+，FOXP3+及CD25+FOXP3+细胞的比例变化不大. 无论CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+CD25+T细胞的比例，还是CD4+CD25hiFOXP3+T细胞占CD4+CD25hi T细胞的比例，在所有研究对象中均呈下降趋势（前者从59.8%降到52.0%，后者从86.3%降到77.9%，P<0.05）.

　　表1细胞计数及流式细胞检测结果(略)

　　3讨论

　　CD25是CD4+调节性T细胞的标记，新鲜活化的CD4+T细胞虽也表达，但无免疫抑制作用. 近年来，有用CD25hi作为调节性T细胞标记［3-4］，最近FOXP3是调节性T细胞的最可靠标记［5-6］. 我们用三色流式细胞术在单细