作者：聂晓敏，周玉杰，谢英，李艳芳

【关键词】  二烯丙基三硫化物；,血管成形术；,支架；,iNOS蛋白;,,一氧化氮

　　Effect of diallyl trisulfide coated stents on iNOS protein expression and NO level in canine models of coronary restenosis

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of diallyl trisulfide coated stents on iNOS protein expression and NO level in the canine models of coronary restenosis, and to explore the mechanisms of diallyl trisulfide coated stents inhibiting neointima formation. METHODS: The diallyl trisulfide coated stent and the control stent were implanted into distal and proximal left circumflex coronary arteries of 20 dogs, respectively. They were sacrificed 1, 3, 10 and 28 d after stenting. The expression of iNOS proteins was assessed by Western blot and the NO level was measured by nitrate reductase. RESULTS: Expression of iNOS proteins was seen on day 1 following the control stent implanting, developed on day 3, peaked on day 10 and lasted till day 28. iNOS expressions at all time points in diallyl trisulfide coated stent group were higher than those in control stent group. Compared with normal blood vessel tissue, the NO production after stenting decreased on day 1, increased on day 3, maximized on day 10, went down to its prestenting level on day 28. At all time points, NO levels in allitridistented sites were higher than those in controlstented sites. CONCLUSION: Diallyl trisulfide coated stent could significantly enhance the iNOS expression and NO production, which may play an important role in inhibiting neointimal hyperplasia.

　　【Keywords】 diallyl trisulfide；angioplasty; stent;  iNOS proteins; nitric oxide

　　【摘要】 目的：研究二烯丙基三硫化物涂层支架对犬冠状动脉损伤后血管壁内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达及NO水平的影响. 方法：进行冠状动脉左回旋支支架置入术的犬，将二烯丙基三硫化物涂层支架和对照支架分别置入左回旋支的远端和近端. 术后1，3，10和28 d分别处死动物，蛋白质印迹杂交法测定血管壁中iNOS蛋白的表达、硝酸还原酶法检测NO水平. 结果： 对照支架组术后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白表达，3 d表达增加，10 d达高峰，28 d时仍有表达，二烯丙基三硫化物涂层支架组iNOS蛋白在各时间点的表达量均高于对照支架组；对照支架组术后1 d时NO生成量低于正常组织，3 d时NO水平升高，10 d时最高，28 d时降至基线水平，二烯丙基三硫化物涂层支架组各时间点的NO水平明显高于对照支架组. 结论：二烯丙基三硫化物涂层支架可显著增加iNOS表达，并提升NO产量，提示二烯丙基三硫化物涂层支架可能是抑制内膜增生的一个重要机制.

　　【关键词】 二烯丙基三硫化物； 血管成形术； 支架； iNOS蛋白;  一氧化氮

　　【中图号】 R541.405

　　0引言

　　研究已证实血管损伤后诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在血管平滑肌细胞（VSMC）中大量表达［1-4］，但这种高表达对内膜增殖的意义尚处在争议之中. 先前的实验结果表明二烯丙基三硫化物涂层支架可显著抑制犬冠状动脉损伤后内膜增生［5］. 我们通过观察二烯丙基三硫化物涂层支架对犬冠状动脉损伤后血管壁内iNOS蛋白表达及NO水平的影响，来探讨iNOS在内膜增生中的作用，并进一步阐明二烯丙基三硫化物涂层支架的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸钠（SDS），Tris，NP10，Leupeptin和蛋白标准品均为Sigma公司产品；Lumiol发光底物和iNOS多克隆抗体为Santa Cruz产品；HRP耦联山羊抗兔IgG购自北京中山公司；NO试剂盒，南京聚力生物医学工程研究所；密度扫描仪，美国BioRad，Model GS700；显微镜微机彩色图像处理系统，BHEC型，北京惠中公司.

　　1.2方法

　　1.2.1模型的建立杂种犬，体质量25~30 kg，呈仰卧位缚于导管床,建立静脉通道并予以心电监护. 戊巴比妥钠麻醉后右股动脉穿刺，插入自行塑型的7F冠状动脉导引管进行冠状动脉造影，将支架用生理盐水湿润后固定在PTCA球囊上（球囊/动脉直径之比为1.3∶1），将二烯丙基三硫化物涂层支架和对照支架（制作方法同二烯丙基三硫化物涂层支架，只是不浸泡二烯丙基三硫化物液）分别植入左回旋支的远端和近端. 术后口饲阿斯匹林250 mg/d至处死.

　　1.2.2病理学检查术后28 d，取出支架置入处冠状动脉血管于40 g/L甲醛中固定，带支架的血管用塑料包埋，碳化钨钢刀切片，HE染色，光镜下观察. 计算机图像分析系统测量内膜面积平均的内膜（每个支架丝至管腔的距离）和中膜厚度（相邻两个支架丝之间的中膜的厚度）.

　　1.2.3蛋白质Western blot支架置入术后1，3，信捷职称论文写作发表网，10和28 d（n=8）分别处死动物，取出支架置入处冠状动脉血管. 剥离血管外附着的结缔组织，剪碎，加入1 mL裂解液（10 mmol/L Tris和10 g/L SDS），冰浴条件下进行组织匀浆. 用考马斯亮蓝方法测蛋白质的浓度. 根据标准曲线计算样本蛋白浓度. 取15 μg蛋白，加入上样缓冲液，煮沸5 min后进行120 g/L SDSPAGE电转膜，用1∶1000的抗iNOS多克隆抗体进行杂交，采用1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，利用化学发光法进行显色反应，用图像分析系统对所得区带积分光密度进行扫描.

　　1.2.4一氧化氮（NO）水平测定标本处理、储存和组织匀浆液提取同Western blot，-80℃保存. 按照试剂盒说明测定NO水平.

　　统计学处理: 数据用x±s表示，SPSS统计软件处理，两组数据间比较采用t检验，多组比较采用多个样本均数比较的ANOVA方差分析，两两比较采用NewmanKeuls法q检验. P<0.05表示有显著性差异.

　　2结果

　　2.1病理学术后28 d，对照支架组血管内膜明显增生，支架丝处中膜受压，轻度萎缩；二烯丙基三硫化物支架组血管内膜增生较对照组显著减轻（图1），计算机图像分析结果有差异（表1）.

　　2.2支架置入术后iNOS蛋白表达Western blot及其积分光密度分析结果显示，正常动脉的iNOS蛋白表达量为0.80±0.12，对照支架置入术后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白（4.3±0.6）表达，术后3 d（14.1±2.7）表达增加，术后10 d（37.3±2.5）达高峰，28 d（11.5±1.3）时仍可检测到iNOS蛋白表达（图2）. 二烯丙基三硫化物涂层支架组iNOS蛋白表达的动态变化规律同对照支架组，但在各时间点的表达量（1 d：29±4；3 d：49.9±3.0；10 d：101±12；28 d：38±3，P均＜0.01）均高于对照支架组.

　　图1病理学观察支架置入28 d后内膜增生情况HE ×200（略）

　　表1术后28 d, 二烯丙基三硫化物涂层支架组和对照支架组结果比较（略）

　　图2对照支架和二烯丙基三硫化物涂层支架置入犬冠状动脉后iNOS蛋白表达（略）

　　2.3支架置入术后一氧化氮水平支架置入后血管组织中一氧化氮水平变化与iNOS蛋白变化基本一致，术后1 d时一氧化氮生成量［(42±7) μmol/L］低于正常组织［(110±12) μmol/L］，3 d时一氧化氮水平［(126±17) μmol/L］升高，10 d时［(396±39) μmol/L］最高，28 d时为［(195±41) μmol/L］降至基线水平. 二烯丙基三硫化物涂层支架组术后1, 3和10 d时一氧化氮水平［(170±29) μmol/L，P＜0.05；(393±58) μmol/L，P＜0.05；(780±115) μmol/L，P＜0.01］明显高于对