作者：张晓战，南克俊，李春利，陈玲
【关键词】 ,p34cdc2激酶;,,增殖细胞核抗原;,肝细胞癌；细胞周期
【Abstract】 AIM: To study the expression of p34cdc2 in hepatocellular carcinoma (HCC) and the relationship between the expression of p34cdc2 and proliferative index (PI)， apoptotic index (AI) of HCC. METHODS: Fortyseven cases of HCC with 42 specimens of neighboring noncancerous tissues and 10 healthy hepatocellular tissues were selected for the study. These samples were detected by SP immunohistochemical and TUNEL methods. All data were processed by SPSS 10.0 version in computer. RESULTS: The expression of p34cdc2 was localized in cytoplasm and nuclear of HCC tissues, and neighboring noncancerous tissues, showing brownish yellow or yellow. There was p34cdc2 overexpression in HCC, compared to normal liver tissues (P<0.01). PI of HCC and neighboring noncancerous tissue was (30.34±4.46)% and (27.88±5.89)% respectively. AI of HCC and neighboring noncancerous tissue was (8.62±2.28)% and (7.38±2.61)% respectively. AI and PI in HCC were higher than those in neighboring noncancerous tissue (P<0.05). PI was significantly higher in p34cdc2 protein positive tissues ［(49.26±4.81)%］ than in p34cdc2 protein negative tissues ［(23.07±4.15)%］ (P<0.05), but p34cdc2 protein expression was not significantly related to AI (P>0.05). CONCLUSION: There is an overexpression of p34cdc2 in HCC. AI and PI in HCC are both higher than those in neighboring noncancerous tissue. Although it is not a prerequisite for HCC cell apoptosis, p34cdc2 expression is positively associated with PCNA expression in HCC, and can together with PCNA serve as a sensitive parameter for detecting HCC cell proliferation.
【Keywords】 p34cdc2; PCNA; hepatocellular carcinoma; cell cycle
【摘要】 目的: 探讨p34cdc2激酶在肝细胞肝癌（HCC）发生发展中的作用及与增殖和凋亡的关系. 方法：收集HCC（含癌旁组织42）标本47例，正常肝组织10例，采用免疫组织化学SP法显示p34cdc2激酶的表达并结合增殖与凋亡特征进行分析. 结果：在肝癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织细胞中p34cdc2表达定位于胞质中，在癌组织中过表达，差异有统计学意义（P<0.01）. 肝癌、癌旁组织中的增殖指数（PI）分别为（30.34±4.46）%与（27.88±5.89）%，肝癌组织明显高于癌旁组织（P<0.05）；肝癌、癌旁组织中的凋亡指数（AI）分别为（8.62±2.28）%与（7.38±2.61）%，肝癌组织明显高于癌旁组织（P<0.05）；p34cdc2蛋白阳性组PI（49.26±4.81）%显著高于阴性表达组(23.07±4.15)%（P<0.05），AI无明显差异（P>0.05）. 结论：HCC中增殖与凋亡均高于癌旁组织；p34cdc2和PCNA一样可作为反映HCC细胞分裂增殖能力的有效指标；p34cdc2并不是HCC凋亡所必须.
【关键词】 p34cdc2激酶; 增殖细胞核抗原; 肝细胞癌；细胞周期
0引言
p34cdc2激酶(简称cdkl)在真核生物细胞周期G2→M期检查点起着正性调节作用. 人们发现细胞周期失控是细胞恶变的重要原因. p34cdc2激酶在多种实体瘤中有过表达现象. 为检测HCC中p34cdc2激酶的表达情况及其与增殖和凋亡的关系，我们采用免疫组织化学法对47例HCC组织(42例含癌旁组织）及10例正常肝组织进行了研究.
1材料和方法
1．1材料199901/200401西安交通大学第一医院手术切除47（男38，女9）例HCC标本，42例含癌旁组织. 年龄29~77（平均54.3）岁. 所有标本均经病理明确诊断. 低分化18例，中分化21例，高分化8例. TNM分期Ⅰ期1例，Ⅱ期12例，Ⅲ期16例，Ⅳ期18例. 另10例正常肝组织标本取自健康成年男性意外死亡者. 浓缩型mAb p34cdc2 SP试剂盒购自美国NeoMarkers公司. PCNA购自北京中山生物技术公司. 原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国保灵曼公司. 羊血清及DAB试剂盒购自福州迈新公司.
1．2方法p34cdc2，PCNA常规免疫组化SP法. 石蜡切片经二甲苯脱腊，梯度乙醇水化，抗原修复(切片置于10 mol/L柠檬酸钠缓冲液pH 6.0内，热修复5 min×3)，1∶50正常羊血清封闭20 min，PBS冲洗，加入1∶50稀释的一抗，温盒内37℃孵育2 h，PBS冲洗，加二抗，DAB显色，苏木素复染. 以PBS代替一抗设立空白对照，以切片内癌旁区作自身对照，p34cdc2或PCNA阳性片作阳性对照. 凋亡：TUNEL法：按操作手册方法进行，其步骤简述如下：切片常规脱蜡、水化；PBS缓冲液冲洗5 min×3；同免疫组化微波热修复处理15 min；PBS缓冲液冲洗5 min×3；加TUNEL液(A液和B液按1∶9混合而成)50 μL，37℃下恒温箱内孵育1 h；PBS缓冲液冲洗5 min×3；每张切片加上抗荧光素抗体(C液) 50 μL，湿盒内37℃下孵育40 min；PBS缓冲液冲洗5 min×3；加入新鲜配制的BCIP/NBT显色液，显微镜下观察显色15~30 min；自来水冲洗，核快红复染；脱色、透明、中性树胶封片. 以PBS代替TUNEL液设空白对照，阳性对照用凋亡阳性片. 结果判定 p34cdc2：光镜下每张切片在HCC组织中随机选取高倍视野计数500个细胞. 先按阳性细胞百分率记分：阳性细胞≤5%为0分，阳性细胞数6%~25%为1分，阳性细胞数26%~50%为2分，阳性细胞数51%~75%为3分，阳性细胞数>75%为4分. 其次，按染色强度计分，无染色0分，弱染色1分，强染色2分. 最后将两项合并，得0分为阴性（－），1~2分为弱阳性（+），3~4分为阳性（），5~6分为强阳性（）. PCNA阳性染色为细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒；凋亡阳性细胞为细胞核内出现蓝紫色颗粒. 根据光镜下观察的显色反应，采用双盲法，随机选择5个高倍镜视野，计数总细胞数及染色阳性细胞数. 染色指数>10%的切片为阳性切片. 增殖指数(proliferating index，PI=PCNA染色阳性细胞数/总细胞数×100%)及凋亡指数(apoptotic index, AI=TUNEL染色阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%).
统计学处理：使用SPSS.10统计软件. 表1资料应用Kruskal Wallis秩和检验进行分析，组间多重比较用Wilcoxon秩和检验进行分析. 两样本均数比较采用t检验. P<0.05认为具有统计学意义.
2结果
2．1p34cdc2表达的测定在HCC细胞、癌旁细胞及正常肝细胞中p34cdc2均主要定位于细胞质中，呈棕黄色或黄色，胞核中也有棕黄色或黄色着色（图1）. 在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织p34cdc2的阳性表达率分别为81.4%，67.4%，40.0%. Kruskal Wallis秩和检验分析显示p34cdc2在不同组织中表达强度有统计学意义（χ2=27.698，P=0.000）. 与正常肝组织比较p34cdc2在癌组织中有过表达现象（P=0.001），而在癌旁组织中表达无统计学差异（P=0.115，表1).表1p34cdc2在不同肝组织部位的表达
2.2PCNA的测定PCNA定位于细胞核，为棕黄色或棕褐色颗粒（图1）. HCC组织PI高于癌旁肝组织［（30.34±4.46)% vs (27.88%±5.89)%］, 有统计学意义（P=0.028）.
2．3凋亡的测定凋亡细胞在HCC组织中呈散在分布（图1）, HCC组织中AI高于癌旁肝组织［（8.62±2.28)% vs (7.38±2.61)%］，有统计学意义（P=0.019）.
2．4HCC组织中p34 cdc2蛋白表达与细胞增殖和凋亡的关系p34cdc2蛋白阳性组PI为(49.26±4.81)%，阴性表达组为(23.07±4.15)% ，有统计学意义（P=0.021）. p34cdc2蛋白阳性组AI(8.72±1.83)%，阴性表达组(8.43±2.55)%，无统计学意义（P=0.632）.
3讨论
