2.2新生小鼠睾丸组织学改变光镜下，对照组PND 5小鼠生精小管呈实心的索状（性索），PND15小鼠部分生精小管开始管腔化，生精细胞层次少，层次清楚，约3～4层，细胞结构正常. 睾丸间质分布于生精小管之间，比较疏松,Leydig细胞数量少，散在分布. Leydig细胞大，核圆形或椭圆形，位于细胞中央（图1A）. DEHP各剂量组小鼠睾丸均出现明显的病理性改变：生精细胞程度不等的变性，信捷职称论文写作发表网，细胞核边界不清楚，核形状不规则；Leydig细胞数量增多，以中、高剂量组PND 15小鼠睾丸为甚，Leydig细胞变性，细胞核不规则，胞质及部分胞核内见大小不一的空泡，细胞常聚集成团，或排列成较大的细胞簇（图1B，C）.
2.3原代Leydig细胞INSL3 mRNA的表达溶剂对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；DEHP 50 mg/L组平均A值比对照组低（0.106±0.011 vs 0.122±0.013, 0.120±0.010, P<0.05）；DEHP 100和200 mg/L组与对照组、DEHP 50 mg/L组比较，A值降低（0.078±0.008, 0.072±0.008 vs 0.122±0.013, 0.120±0.010, 0.106±0.011, P<0.01).
2.4原代Leydig细胞及新生小鼠睾丸INSL3 mRNA的表达相对强度溶剂对照组与空白对照组差异无统计学意义（0.958±0.084 vs 0.982±0.063, P>0.05）；各实验组(DEHP 50, 100和200 mg/L组)INSL3 mRNA表达相对强度比对照组降低（0.820±0.050, 0.756±0.078, 0.702±0.052 vs 0.958±0.084, 0.982±0.063, P<0.05或P<0.01）；DEHP 50 mg/L与DEHP 200 mg/L组两两比较差异有统计学意义（0.820±0.050 vs 0.702±0.052, P<0.05）. 提示：在体外，DEHP抑制Leydig细胞INSL3 mRNA的表达，且效应与剂量有关.
如表1所示，DEHP处理各组的INSL3 mRNA的表达相对强度在雄性仔鼠出生早期（PND 5）与对照组比较，即明显降低（P<0.01），实验组组间两两比较也有差异（P<0.01）；在PND15时，DEHP处理各组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），DEHP 500 mg/kg・d组INSL3 mRNA的表达相对强度比其他两个实验组高，但实验组两两比较差异无统计学意义（P>0.05）；DEHP实验组与对照组表1新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA相对表达强度的检测（略)比较，INSL3 mRNA表达相对强度的差异在PND15时较PND5有变小的趋势. 提示：DEHP对雄性仔鼠睾丸INSL3 mRNA的表达有影响，其影响与DEHP的剂量有关，差异随仔鼠体外生活时间的延长有变小的趋势.
3讨论
INSL3,睾酮（testosterone）以及抗苗勒氏管激素（antiMullerian hormone,AMH）,对于动物正常的性分化发育起关键作用，如果这三种激素分泌紊乱，将导致动物泌尿生殖系统先天性畸型，如隐睾等［5］. 隐睾为小儿时期最常见的泌尿生殖系统畸型，在足月男婴发生率达3％～4％，是男性不育的主要原因，其发生机制至今不清楚. 早期研究认为睾丸下降分为经腹腔下降和经腹股沟阴囊下降两个阶段，睾丸引带(gubernaculum)和颅侧悬韧带在整个下降过程中发挥重要作用［6］. Emmen等［7］研究发现INSL3、睾酮等作用下的胚胎期睾丸引带发育和颅侧悬韧带退化是保证睾丸正常下降的关键因素，经腹腔下降期主要由INSL3诱导睾丸引带细胞增生，同时，睾酮促进颅侧悬韧带退化，促使睾丸从腹腔内下降到腹股沟，经腹股沟阴囊下降期睾酮进一步促进睾丸引带发生退化、收缩，引导睾丸从腹股沟降入阴囊内. 在剔除了INSL3基因的小鼠模型中，INSL3-纯合子(INSL3-/-)小鼠发生双侧腹腔内高位隐睾，而分化发育依赖雄激素的雄性生殖器官相对正常；雄性INSL3-/-胎鼠组织学显示,Wollfian管结构正常，苗勒氏管消失，而引带发育受到严重影响，睾丸引带细小，分化不良，没有位于中央的间叶细胞带，提示INSL3-/-小鼠的睾酮和AMH的分泌正常，引带的发育不良与INSL3基因缺失密切相关［8］. LGR8/Great被认为是INSL3与之结合并发挥作用的唯一受体，主要表达于睾丸引带、附睾等组织. 在转染细胞中LGR8能与极低浓度的INSL3特异性结合并促进睾丸下降,LGR8基因突变，缺失都可以引起引带发育异常和隐睾发生［9-11］. 因此INSL3被认为是促进睾丸正常下降的重要激素.
大量研究证实INSL3由睾丸Leydig细胞分泌，如果睾丸Leydig细胞受各种理化因素影响，INSL3分泌功能发生紊乱，将间接影响睾丸引带的发育及分化. 睾丸Leydig细胞是环境内分泌干扰因子DEHP作用的靶细胞之一［12-13］，我们前期研究发现DEHP通过对小鼠孕鼠灌药，可成功诱导出仔鼠隐睾模型［14］. 在此基础上，我们在本实验中，进一步观察DEHP对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响，结果发现DEHP对原代培养的睾丸间质细胞有明显的增殖抑制作用，贴壁生长的细胞脱落，上浮，崩溃溶解，死亡细胞数增加；胚胎期接触DEHP的仔鼠睾丸Leydig细胞不同程度的变性，细胞核不规则，胞质及部分胞核内出现大小不一的空泡，细胞聚集成团，或排列成较大的细胞簇，而接触中、高剂量DEHP的仔鼠睾丸Leydig细胞反应性增生. 通过原位分子杂交技术和RTPCR检测,各实验组INSL3 mRNA表达水平与对照组比较差异有统计学意义，提示DEHP可有效下调INSL3 mRNA的表达. 在体实验中，DEHP 500 mg/kg・d组在PND15时，睾丸组织学可见Leydig细胞数量明显增多，但INSL3 mRNA表达的相对强度仍低于对照组（P<0.05）,表明反应性增生的Leydig细胞发育不成熟，功能不完善. 小鼠睾丸INSL3 mRNA表达相对强度与对照组比较，在PND15时其差异程度比PND5时有减小的趋势，提示：DEHP对Leydig细胞INSL3 mRNA表达的抑制可能呈阶段性. 推测DEHP间接影响睾丸引带的发育，是导致隐睾发生的机制之一.
【参考文献】
［1］ Mahood IK, Hallmark N, McKinnell C, et al. Abnormal Leydig cell aggregation in the fetal testis of rats exposed to Di (nbutyl) phthalate and its possible role in testicular dysgenesis［J］. Endocrinology, 2005, 146(2):613-623.
［2］ Barlow NJ, Foster PM. Pathogenesis of male reproductive tract lesions from gestation through adulthood following in utero exposure to Di(nbutyl) phthalate［J］. Toxicol Pathol, 2003, 31(4):397-410.
［3］ Koch HM, Preuss R, Angerer J. Di(2ethylhexyl)phthalate (DEHP): Human metabolism and internal exposure - an update and latest results［J］. Int J Androl， 2006, 29(1):155-165.
［4］ 宋晓峰，魏光辉，邓永继. 小鼠胚胎睾丸Leydig细胞培养、纯化及其功能研究［J］.中华男科学杂志，2006，12(1):6-9.
［5］ Nef S, Parada LF. Cryptorchidsim in mice mutant for INSL3 ［J］. Nat Genet, 1999, 22(3):295-299.
［6］ Hutson JM, Hasthorpe S. Abnormalities of testicular descent［J］.Cell Tissue Res， 2005，322(1): 155-158.
［7］ Emmen JM, McLuskey A, Adham IM, et al. Hormonal control of gubernaculum development during testis descent: Gubernaculum outgrowth in vitro requires both insulinlike factor and androgen［J］. Endocrinology, 2000, 141(12):4720-4727.
［8］ Zimmermann S, Steding G, Emmen JM, et al. Targeted disruption of the INSL3 gene causes bilateral cryptorchidism［J］. Mol Endocrinol, 1999, 13(15):681-691.
