1.2.5S.pn体内清除时间测定将TIGR 4及△HtrA于C+Y培养基中培养到A620 nm>0.5，用无菌PBS稀释到菌密度为5×107 cfu/mL. 将48只Balb/c小鼠随机分为两组，分别注射100 μL野生株TIGR 4和100 μL缺陷株△HtrA菌液. 于注射菌液后12，24，36，48 h取小鼠心脏血（每时间段6只），系列稀释后将野毒株株血标本接种于TSA血平板，缺陷菌株血标本接种于含氯霉素（2.5 mg/L）TSA血平板. 37℃，50 mL/L CO2孵箱培养24~48 h，计数菌落，观察细菌在体内被清除情况. 最终的结果以6只老鼠血液中细菌计数的平均值表示.
统计学处理：数据以x±s表示，方差齐同时采用t检验，方差不齐时采用t′检验，P<0.05为有统计意义，小鼠毒力实验结果采用Longrank检验，以SAS统计软件进行分析.
2结果
2.1肺炎链球菌HtrA缺陷菌株的获得利用插入复制失活的方式构建HtrA缺陷菌株△HtrA. PCR扩增出HtrA基因405 bp，然后用Bgl II和Sph I分别将HtrA和pEVP3进行双酶切，胶回收目的片段(图1). 连接后转于DH5α获得重组质粒pEVP3HtrA.
用Hind III酶切pEVP3HtrA后可见大（约6250 bp）,小（约450 bp）两个片段(图2A). 以pEVP3多克隆位点两侧测序引物PCR鉴定，表明pEVP3HtrA在660 bp处有目的片段，而pEVP3因没有重组HtrA基因片段，扩增出片断长度仅250 bp(图2B).
将pEVP3HtrA转化S.pn TIGR 4，从而得到HtrA基因缺陷菌株△HtrA. 用HtrA上游引物与pEVP3多克隆位点下游测序引物进行PCR鉴定，pEVP3HtrA和△HtrA由于有HtrA基因片段的插入，在660 bp左右均可见目的片段，而TIGR 4和pEVP3则没有该片段的产物(图3).
转化试验发现：HtrA缺陷后，其转化能力与其野毒株TIGR 4相比明显下降，甚至完全消失(表2).表2S.pn TIGR 4和△HtrA转化力比较（略）
2.2半定量RTPCR分别测定TIGR 4和△HtrA几个毒力因子的mRNA水平，结果见图4和表3.RT表3Quantityone 3.0软件分析的毒力基因表达量与相应16s rRNA表达量的比值（略）
PCR结果显示野毒株株和缺陷菌株的毒力基因lytA(254 bp), nanA(200 bp)和pspA(250 bp)都有一定量的表达，但△HtrA的表达量较之野毒株明显下降.
2.3小鼠毒力试验野毒株半数致死时间22 h，而缺陷菌株半数致死时间为8 d. 两者毒力具有显著性差异（Longrank分析：χ2=31.26, P<0.01）.
2.4S.pn体内清除测定在注射野毒株菌液后48 h，小鼠体内菌密度仍较高，而缺陷菌于注射后36 h大部分被清除，48 h后小鼠体内缺陷菌几乎全部被清除, 缺陷菌的清除速度明显快于野毒株(表4).表4S.pn在小鼠体内细菌计数情况(略）
3讨论
S.pn是一种常见的条件致病菌，可导致严重的后果，其致病力研究的热点往往集中在荚膜和毒力因子上，也就是注重对单个细菌的研究，而不注重S.pn群体的研究. 密度感应系统(Quorum Sensing，QS)是细菌的一种群体行为调控机制，它控制着细菌的多种生命活动［15］. S.pn为革兰氏阳性菌，其QS为通过磷酸化去磷酸化介导的双成分系统（TCS）. 目前发现S.pn有13对TCS，其中CiaRH参与了对HtrA的调控. 本研究正是从CiaRH调节的HtrA出发，探索其对S.pn毒力的影响.
插入复制失活方式致基因缺失这一技术是目前基因功能研究最常用的方法. 这种方法利用携带有目的基因某一段核酸序列的穿梭质粒，通过同源重组整合到宿主染色体上，从而使该基因断裂，改变或丢失原有功能，根据穿梭质粒的抗性标记，可筛选出缺陷菌株. 这种方式简便易行可靠性高，且易验证成功与否. 本研究中，将HtrA基因的一段序列克隆到穿梭质粒pEVP3上，再转化S.pn，从含有氯霉素的血平板上得到HtrA缺陷株.
从毒力基因的mRNA表达来看，HtrA缺陷后PspA，NanA和LytA 3种毒力因子的表达均下降. PspA可减少补体在细菌表面沉积，便于S.pn在体内增殖［16］. NanA位于细菌表面，信捷职称论文写作发表网，能清除细胞表面的多糖如粘蛋白、糖脂和糖蛋白，破坏宿主细胞的糖苷，促进细菌定植后向宿主侵袭［16］. LytA使S.pn自溶，释放出内部的各种因子，触发宿主炎症反应［16］. 以上毒力因子均在S.pn致病过程中发挥了重要作用. 我们的研究表明，HtrA缺陷后这些毒力因子表达量都显著下降，这可能是S.pn毒力下降的原因之一.
小鼠毒力试验结果表明，HtrA缺陷菌毒力显著减低，小鼠存活时间明显延长；HtrA缺陷菌于小鼠体内的浓度也明显低于野毒株，缺陷菌在体内迅速被清除，不能象野毒株一样在体内大量存活. 而S.pn引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病都必须粘附于内皮细胞后才能进一步入侵宿主细胞，一旦粘附侵袭能力下降或体内活菌减少，能粘附入侵宿主细胞的细菌也就相应减少，则不易引起疾病发生. 这也验证了这样一个推断：HtrA编码的丝氨酸蛋白酶可能位于S.pn表面［13］，同时揭示了HtrA缺陷后S.pn毒力下降的一个重要原因.
从转化来看，HtrA缺陷后S.pn的转化率显著下降. S.pn的转化控制着许多基因的表达，进入感受态后，可启动大量蛋白的表达（包括毒力因子），同时也有另一些蛋白的表达被关闭. 我们的前期工作发现S.pn转化缺陷菌株的NanA，LytA，透明质酸酶三种毒力因子表达较野生株弱，表明转化有利于S.pn毒力基因表达［17］. 这也说明HtrA缺陷不仅可以直接使几种重要毒力因子的表达减弱，还可能通过降低转化力来间接影响S.pn毒力.
本实验研究表明HtrA基因缺陷可从多方面减弱S.pn毒力，为从基因的角度研究HtrA在S.pn致病过程中的作用提供了重要的实验依据. HtrA与自然转化的密切关联，提示其可能与S.pn的条件致病相关，可为深入研究S.pn条件致病的发病机制提供全新的思路. 另外，HtrA受S.pn的TCS之一CiaRH调控［11］，对HtrA的研究也有助于理解TCS在S.pn中对毒力的调节，使我们的思维角度从单个细菌转变到对细菌群体的研究.
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