【关键词】  呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8+T细胞；CD8单克隆抗体；气道炎症

    【Abstract】 AIM:  To evaluate the effect of antiCD8 monoclonal antibody (antiCD8mAb) on airway inflammation of Balb/c mice with respiratory syncytial virus(RSV)induced asthma. METHODS:  Fifty mice were randomly divided into 5 groups (n=10 each group): PBS control group, OVA group, OVA/RSV group, antiCD8mAb treated group and  IgG2αmAb treated control group. Lung histopathological changes were evaluated by HE stain. Airway responsiveness was assessed using a whole body plethysmography. Cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were counted and classified and the supernatants of the BALF were used for detection of interleukin（IL）4, IL5 and interferon（IFN）γ. The percentage of CD4+（IFNγ+, IL4+, IL5+）, CD8+（IFNγ+, IL4+, IL5+）T lymphocytes and the ratio of Th2/Th1, Tc2/Tc1 in peribronchial lymph nodes(PBLN) were analysed by threecolor flow cytometry method. RESULTS:  Intraperitoneal administration of antiCD8mAb can remarkably inhibit airway inflammation and airway hyperresponsiveness(AHR). Eosinophils and IFNγ, IL4, IL5 levels in BALF decreased in antiCD8mAb therapeutic group compared with OVA/RSV group（P<0.01, respectively）. The percentage of CD8+（IFNγ+, IL4+, IL5+）T lymphocytes and the ratio of Tc2/Tc1 decreased in antiCD8mAb therapeutic group compared with OVA/RSV group（P<0.01, respectively）. A close correlation between the percentage of CD8+（IFNγ+, IL4+, IL5+）T lymphocytes and IFNγ, IL4, IL5 levels in BALF from OVA/RSV group, antiCD8mAb therapeutic group was demonstrated (rs=0.765, P<0.01; rs=0.825, P<0.01; rs=0.893, P<0.01). CONCLUSION: AntiCD8mAb might suppress airway inflammation and AHR through the mechanism that CD8+T lymphocytes transfer from Tc1 to Tc2, which may be relative to the increase of IL4,  IL5, the gathering of inflammatory cells in the airway and AHR.

    【Keywords】 respiratory syncytial viruses;  asthma; CD8+T lymphocytes; antiCD8 monoclonal antibody; airway inflammation

    【摘要】  目的： 观察CD8mAb对呼吸道合胞病毒（RSV）诱导哮喘小鼠气道炎症的影响. 方法： Balb/c小鼠50只，随机分成5组（n=10）： 磷酸盐缓冲液（PBS）对照组；卵白蛋白（OVA）组；OVA/RSV模型组；CD8mAb治疗组；IgG2αmAb治疗对照组. 应用OVA腹腔注射致敏、OVA气道雾化结合RSV滴鼻激发复制小鼠哮喘模型，观察实验动物气道炎症和气道反应性变化，支气管肺泡灌洗液（BALF）作细胞分类计数，测定BALF上清中白细胞介素（IL）4, IL5, 干扰素（IFN）γ含量并采用三色光流式细胞分析法检测气管旁淋巴结（PBLN）中CD4+, CD8+T细胞及细胞内细胞因子IFNγ, IL4, IL5表达. 结果： 与模型组相比，CD8mAb可明显减轻小鼠气道炎症和气道高反应. CD8mAb治疗后BALF中嗜酸性粒细胞及上清中细胞因子IFNγ, IL4, IL5含量明显减少（P均<0.01），CD8+（IFNγ+, IL4+， IL5+）T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显下降（P均<0.01）.  PBLN中CD8+（IFNγ+, IL4+， IL5+）T细胞百分比与BALF中IFNγ, IL4, IL5含量呈显著正相关(分别rs=0.765,  P<0.01; rs=0.825,  P<0.01;  rs=0.893, P<0.01).  结论： CD8mAb对RSV诱导的哮喘小鼠气道炎症和气道高反应具有抑制作用，其部分机制可能与致敏条件下病毒感染引起CD8+T细胞功能发生转化，即由产生IFNγ为特征的细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL4, IL5为特征的非细胞毒CD8+T细胞有关.

    【关键词】  呼吸道合胞病毒；哮喘；CD8+T细胞；CD8单克隆抗体；气道炎症

      0引言

    临床及流行病学研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因［1］. Osullivan等［2］在因重度哮喘死亡患者的肺标本中检测到呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）,鼻病毒基因组，并发现气管旁有大量CD8+T细胞浸润，且CD8+T细胞表面分子CD25,穿孔素表达增高，提示重度哮喘患者气道局部存在CD8+T细胞数量和功能的异常.  Schwarze等［3］的研究表明，病毒诱导的哮喘与过敏性哮喘在气道炎症的发生机制上有所不同，前者的Th2型炎症主要由CD8+T细胞产生和维持，而后者主要由CD4+T细胞产生和维持. 上述研究提示，CD8+T细胞在呼吸道病毒诱导的哮喘发作及急性加重中起重要作用. 因此，我们采用RSV诱导的小鼠哮喘模型，观察CD8mAb对哮喘气道炎症和气道反应性的影响.

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1动物、试剂和仪器清洁级雌性Balb/c小鼠50只（中国科学院上海动物中心），6~8周龄，体质量17~20  g. 乙酰胆碱（acetylcholine, ACH）,卵白蛋白（ovalburmin,OVA）（Sigma）; IFNγ, IL4, IL5酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂Kit（Biosource）; 大鼠抗小鼠CD8a(Ly2) mAb，大鼠抗小鼠IgG2αmAb对照抗体（BD PharMingen）;流式细胞检测试剂盒包括：刺激剂卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（phorbol myristate acetate, PMA）,离子霉素（Inomycin）, 阻断剂(brefeldinA,BFA)，大鼠抗小鼠PECy5标记CD3， FITC标记CD8，PE标记IFNγ, IL4, IL5 mAb及大鼠IgG1阴性对照(Caltag);动物肺功能体描箱，呼吸机(北京鑫奥成科技有限公司提供)；软件分析系统（AniRes 2003 for Windows 98/2000/XP），酶标仪（Sunrise），真空冻干机（LABCONCO），FACScalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）.

    1.1.2细胞和病毒RSV Long株A型（南京医科大学微生物学与免疫学教研室提供）;人喉癌上皮细胞（HEp2）（中国预防医学科学院病毒研究所惠赠）. HEp2细胞在含100 mL/L灭活胎牛血清的DMEM中37℃, 50 mL/L CO2条件下培养，细胞长满单层后，RSV接种HEp2细胞，继续在含20 mL/L灭活胎牛血清的DMEM的维持液中培养，待细胞病变达100%时收获病毒，并冻存于-80℃冰箱中，反复冻融、离心后，留上清备用. 参照文献［4］的方法采用空斑形成试验测定病毒滴度，取滴度为1.0×106空斑形成单位（PFu/mL）RSV备用.

    1.2方法

    1.2.1实验分组和动物模型 Balb/c小鼠50只随机分成5组，每组10只，分别为磷酸盐缓冲液（PBS）对照组；卵白蛋白(OVA)组；OVA/RSV模型组；CD8mAb治疗组；IgG2αmAb治疗对照组. 动物分别于第1，14日腹腔注射致敏液0.2 mL（0.8 g/L OVA 0.1 mL和等体积液态铝混合），第15日起将小鼠置于透明密闭容器中以10 g/L OVA溶液10  mL雾化吸入，每次20 min，隔日1次，连续5 wk，并分别于第21, 35, 49日用滴度为1.0×106 PFu/mL的RSV 50 μL鼻腔滴入，每日观察小鼠症状，信捷职称论文写作发表网，于最后1次RSV滴入4 d后测气道反应性. CD8mAb治疗组和IgG2αmAb治疗对照组分别于RSV应用6 h后按1 mg/kg ip CD8mAb和IgG2αmAb对照抗体.

    1.2.2气道反应性测定小鼠经腹腔麻醉、气管切开后，置密闭体描箱中，吸气管、呼气管、测压管按指示连接，小鼠按频率90次/min、潮气量5~6 mL/kg机械通气，调节呼气末压为-8 cmH2O，记录经肺压、流速、潮气容积变化. 气道反应性用ACH激发后以肺阻力(RL)表示，将ACH分别按浓度（0.5， 1.5， 5.0， 15.0和45.0 g/L）、容积为35 μL/次尾静脉注射激发，经肺压和潮气容积曲线回到基线后，将浓度增加3倍，每次应用ACH后记录至少10次峰反应的肺变量.

    1.2.3肺泡灌洗液（