1.2.4细胞因子测定将BALF上清放入真空冻干机内-70℃冻干后，加入200 μL生理盐水重融，按ELISA试剂说明书检测其中IFNγ, IL14, IL5含量.
1.2.5三色光流式细胞分析取气管旁淋巴结(PBLN)3~4枚，眼科剪仔细剪碎，经300目尼龙膜过筛获单细胞悬液，1200 r/min离心5 min, 将沉淀细胞置于RPMI1640培养液中，调整细胞密度为2.0×105/L，按参考文献［5］的方法进行流式细胞检测.
1.2.6肺组织病理学变化取右肺中叶进行乙醇脱水，石蜡包埋连续切片，常规苏木素伊红（HE）染色观察大体组织病变和炎症细胞浸润情况.
统计学处理： 实验数据以x±s表示，用SPSS11.0统计软件进行分析，气道反应性变化采用析因设计方差分析，其余指标组间比较采用单因素方差分析（ONEWAY ANOVA），相关性采用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2．1气道反应性变化当ACH分别按5， 15 和45 g/L浓度激发时，OVA组RL分别为（3.69±0.32），(5.87±0.59)和(12.59±1.84）cmH2o/(mL・s);与OVA/RSV模型组（5.12±0.54），(9.28±0.86)和(18.94±2.67）cmH2o/(mL・s)比较，两组差异具有统计学意义（P均<0.01）;与OVA/RSV模型组比较，应用CD8mAb后（3.08±0.40），(5.67±0.53) 和(10.86±0.82）cmH2o/(mL・s)，气道反应性明显下降（P均<0.01，图1）. bP<0.01 vs OVA 组； dP<0.01 vs OVA/RSV模型组. OVA：卵白蛋白； RSV： 呼吸道合胞病毒； ACH: 乙酰胆碱.图1各组动物气道反应性变化（n=10, x±s）2.2BALF细胞分类计数及上清细胞因子表达与OVA组比较，OVA/RSV模型组嗜酸性粒细胞及细胞因子IFNγ, IL4, IL5明显升高（P均<0.01）. 应用CD8mAb后嗜酸性粒细胞及细胞因子IFNγ, IL4, IL5明显下降（P均<0.01，表 1）. 表1各组BLAF中细胞分类计数
2.3PBLN中CD4+, CD8+T细胞及胞内细胞因子表达与OVA组比较，OVA/RSV模型组CD8+（IFNγ+， IL4+， IL5+）T细胞百分比及Tc2/Tc1比值明显升高（P均<0.01）. 应用CD8mAb后CD8+（IFNγ+， IL4+， IL5+）T细胞百分比、Tc2/Tc1比值下降（P均<0.01，表 2）.表2各组PBLN中CD4+, CD8+T细胞及胞内细胞因子表达变化
2.4肺组织病理学变化OVA/RSV模型组气道上皮增厚、破坏，管腔狭窄，有支气管收缩征象，管壁周围大量炎症细胞浸润（图2A）. CD8mAb治疗后气道上皮增厚，管腔狭窄，管壁周围炎症细胞浸润较模型组减轻（图2B）. 治疗对照组与模型组比较无明显变化（图2C）. OVA组气道上皮增厚，管壁周围炎症细胞浸润程度亦较模型组减轻（图2D）. PBS组未见明显病理变化（图2E）.
2.5相关性分析经Spearman 等级相关分析, PBLN中CD8+（IFNγ+， IL4+， IL5+）T细胞百分比与BALF中IFNγ, IL4, IL5细胞因子含量呈显著正相关(分别rs=0.765, P<0.01; rs=0.825, P<0.01; rs=0.893, P<0.01).
3讨论
本研究观察到，与OVA组比较，OVA/RSV模型组小鼠气道炎症、肺阻力（RL）明显增加，提示OVA致敏后RSV感染可显著加重哮喘，这与大部分的研究结果相同［6］. 采用流式细胞分析进一步检测PBLN中CD4+（IL4+， IL5+， IFNγ+）,CD8+（IL4+， IL5+，A： OVA/RSV模型组； B： CD8mAb治疗组； C： LgG2αmAb治疗对照组； D： OVA组； E： PBS组.图2各组小鼠肺病理变化HE ×200 IFNγ+）T细胞百分比发现，OVA/RSV模型组CD8+（IFNγ+， IL4+， IL5+）T细胞百分比及Tc2/Tc1比值较OVA组明显升高（P均<0.01），且CD8+（IFNγ+， IL4+， IL5+）T细胞百分比与BALF中IFNγ, IL4, IL5细胞因子含量呈显著正相关，提示与OVA致敏性哮喘不同，OVA致敏条件下RSV感染后BALF中IFNγ, IL4, IL5细胞因子主要来源于CD8＋T细胞，即CD8＋T细胞，尤其Tc2在呼吸道病毒诱导的哮喘加重中起重要作用. 新近研究表明［7］，外源性IL4能体外诱导CD8＋T细胞分泌Th2型细胞因子如IL5, IL13，提示在哮喘患者IL4表达占优势的环境中，病毒感染可刺激CD8＋T细胞合成Th2型细胞因子，这可能是呼吸道病毒加重哮喘的原因.
应用CD8mAb后，OVA/RSV模型组小鼠气道反应性明显下降，BALF中IL4, IL5, IFNγ含量及嗜酸性粒细胞均显著下降，气道周围炎症细胞浸润亦明显减轻，提示CD8mAb可显著抑制RSV感染相关哮喘的气道炎症和AHR. 这可能与致敏条件下在Th2型细胞因子环境中，RSV感染引起细胞毒CD8+T细胞转化为产生IL5的非细胞毒T细胞，CD8mAb对其的抑制可使Th2型细胞因子和嗜酸性粒细胞气道分泌、趋化减少有关. 当然，CD8+T细胞对气道上皮产生直接破坏以及CD8+T细胞介导嗜酸性粒细胞脱颗粒，其中释放的主要碱性蛋白(MBP)能结合气道平滑肌M2受体导致M2受体功能下降，促进AHR［8］，CD8mAb对其的抑制效应可在保护气道上皮、减轻气道炎症和AHR中起一定作用.
综上所述，OVA致敏条件下RSV感染可明显增加气道炎症和气道反应性，其中CD8+T细胞表型的转化加重Th2型气道炎症并导致大量嗜酸性粒细胞气道募集可能起重要作用. 由于临床上病毒诱发的哮喘十分频繁，且与哮喘的急性加重密切相关，针对CD8+T细胞的单克隆抗体治疗有可能在减少哮喘的急性发作，减轻哮喘病情、降低死亡率探索一条新途径.
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